氨基酸的定量测定分析.ppt

2、色氨酸的测定 原理 ： 样品中的蛋白质经碱水解后，游离的色氨酸与甲醛和含铁离子的三氯乙酸溶液作用，生 成哈尔满化合物（norharman），具有特征荧光值，可以进行定量测定。 试剂： (1)0.3mmol/L 三氯化铁-三氯乙酸溶液：称取三氯化铁(FeCl3?6H2O)41mg，加入10%三氯乙酸溶液溶解并定容至500mL。 (2)2%甲醛：量取甲醛溶液(36%～38%)5.5mL，加水至100mL。 (3)色氨酸标准溶液：称取10mg色氨酸，用0.1mol/LNaOH 溶液溶解并定容至100mL, 置棕色瓶中备用,使用时用水稀释成1mg/L的标准溶液 2、色氨酸的测定 操作方法： 称取样品粉末100～200mg于离心管中，加入4mL乙醚,摇匀后过夜，以3000r/min速度离心。将乙醚提取液移入试管内,并用乙醚洗涤残渣3次，收集乙醚液于试管中，于40℃水浴除去醚。残留物中加入6.25mol/L NaOH4mL，火焰封口，于110℃水解16～24h。水 解液用4mol/L HCl 溶液调节至pH6～8 后,用水定容至50mL,过滤备用。 吸取滤液0.2mL，加入2%甲醛0.2mL和0.3mmol/L三氯化铁-三氯乙酸混合液2mL，摇匀后于100℃水浴中加热1h，取出，冷却后用水定容至10mL。在激发波长为365nm，发射波长449nm条件下，测定样品的荧光强度，与色氨酸标样作对照，求出样品中色氨酸含量。 本法在0～10mg/L色氨酸溶液范围内呈良好线性关系。 3、苯丙氨酸的测定 原理： 苯丙氨酸与茚三酮及铜盐反应生成荧光复合物，其荧光复合物在激光波长365nm、发射波长490nm处可以产生最大荧光强度，与标准氨基酸对照，可求出样品中苯丙氨酸的含量，检测时加入L-亮氨酸-L-丙氨酸二肽能增强这一反应。 氨基酸的定量测定 一、氨基酸的一般定量测定 1、甲醛滴定法 2、电位滴定法 3、茚三酮比色法 4、非水溶液滴定法 5、邻苯二甲醛法 6、三硝基苯磺酸法 7、乙酰丙酮法 二、个别氨基酸的定量测定 1、赖氨酸的测定 2、色氨酸的测定 3、苯丙氨酸的测定 4、酪氨酸的测定 5、脯氨酸的测定 6、羟脯氨酸的测定 7、胱氨酸的测定 8、谷氨酸的测定 一、氨基酸的一般定量测定 1、甲醛滴定法 原理：氨基酸具有酸性的羧基（—COOH）和碱性的氨基（—NH2），它们相互作用而使氨基酸成为中性的内盐。当加入甲醛溶液时，—NH2与甲醛结合，从而使其碱性消失。这样就可以用强碱标准溶液来滴定—COOH，并用间接的方法测定氨基酸总量。 1、甲醛滴定法 特点：简单易行、快速方便，与亚硝酸氮气容量法分析结果相近 应用：脯氨酸与甲醛作用时产生不稳定的化合物，使结果偏低 酪氨酸含有酚羧基，滴定时也会消耗一些碱而致使结果偏高 溶液中若有铵存在也可与甲醛反应，往往使结果偏高 试剂：40%中性甲醛溶液（以百里酚酞作指示剂，用氢氧化钠溶液将 40%甲醛中和至淡蓝色） 1g/L百里酚酞乙醇溶液 1g/L中性红50%乙醇溶液 0.1mol/L氢氧化钠标准溶液 1、甲醛滴定法 操作方法：吸取含氨基酸20~30mg的样品溶液2份，分别置于250mL锥形瓶中，各加50mL蒸馏水，其中一份加入3滴中性红指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至由红色变为琥珀色为终点；另一份加入3滴百里酚酞指示剂及中性甲醛20mL，摇匀，静置1min，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至淡蓝色为终点。分别记录两次所消耗的氢氧化钠标准溶液体积。 1、甲醛滴定法 计算结果： 氨基酸态氮含量= 式中：c——氢氧化钠标准溶液的浓度，mol/L V1——用中性红作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL V2——用百里酚酞作指示剂滴定时消耗氢氧化钠标准溶液体积，mL m——测定用样品溶液相当于样品的质量，g 0.014—— N2毫摩尔质量，g/mmol 1、甲醛滴定法 注意事项： ①此法适用于测定食品中的游离氨基酸 ②固体样品应先进行粉碎，准确称样后用水萃取，然后测定萃取液；液体试样如酱油、饮料等可直接吸取试样进行测定。萃取可在50℃水浴中进行0.5h即可。 ③若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。 ④与本法类似的还有单指示剂（百里酚酞）甲醛滴定法，此法用标准碱完全中和—COOH时的pH为8.5~9.5，但分析结果稍偏低，即双指示剂法的结果更准确。 2、电位滴定法 原理:根据氨基酸的两性作