反义cortactin基因真核重组质粒的构建及鉴定论文.docVIP

　　反义cortactin基因真核重组质粒的构建及鉴定论文 许朱定，宋振顺，安家泽，李韧，张福琴，窦科峰 【关键词】 ,基因表达 Construction and identification of rebinant eukaryotic expression vector of human antisense cortical actinassociated protein gene 【Abstract】 AIM: To construct a rebinant eukaryotic expression vectorpcDNA3.0/cortactin containing functional region of human antisense cortical actinassociated protein gene (cortactin), so as to provide a tool for the further study on the impact of cortactin in hepatocellular carcinoma (HCC) metastasis. METHODS: Total RNA ethod from cell line MHCC97. CDNA plified using reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RTPCR). Product of PCR, amplified by being transformed into E.coli Dh5α, ed that cortactin cDNA etastatic HCC cell line MHCC97; reverse transcriptase polymerase chain reaction; human cortical actinassociated protein (cortactin) 【摘要】 目的： 构建一个包含人皮层肌动蛋白（cortactin）反义基因的全部功能区的重组真核表达载体pcDNA3.0/cortactin，为进一步研究人皮层肌动蛋白对人肝癌细胞的转移影响的研究奠定基础. 方法： Trizol试剂法提取体外培养的人肝癌高转移细胞株MHCC97总RNA，经逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）扩增目的片段.freelHI）、pMD 18T载体、Trizol试剂为Takana公司产品；胶回收试剂盒为BioDev公司产品；质粒小量抽提试剂盒为Vgene公司. PCR引物： 根据Gene Bank中查到的cortactin的mRNA序列，用软件Primer Premier5.0设计上下游引物，引物序列如下（划线部分分别是BamHI和XhoI的碱基识别序列，斜体部分为保护序列）：上游引物5′ATACTCGAGGTGGAACAAGACCGAATGGA3′；下游引物 5′TAGGATCCATCCCAGCCAAGGGCACATT3′. 1.2方法 1.2.1高转移肝癌细胞MHCC97培养将购回的细胞经2.5 g/L胰蛋白酶消化传代，培养于含100 mL/L胎牛血清的高糖型DMEM完全培养液中，置于37℃含50 mL/L CO2的孵箱中培养，每3 d换液1次，直至铺满. 1.2.2总RNA的提取用2.5 g/L胰蛋白酶消化培养铺满的肝癌细胞MHCC97，PBS洗涤后转移至1.5 mL微量离心管中，离心1000 g离心10 min，弃上清，加入1 mL Trizol试剂，立即反复抽吸至细胞充分裂解，静置5 min，加入200 μL氯仿剧烈振荡15 s，低温离心机4℃ 12000 g离心20 min，取水相至一新的微量离心管中，加入等体积的异丙醇，4℃静置60 min，低温离心机4℃ 12000 g离心20 min，弃上清，750 mL/L乙醇洗涤沉淀2次、4℃ 5000 g离心10 min，弃上清，沉淀自然干燥3 min，加入15 μL无Rnase水溶解沉淀. 取5 μL行凝胶电泳； 2 μL用于反转录. 1.2.3反转录合成cDNA根据反转录试剂盒的说明用随机六聚体法反转录合成cDNA. 将反应体系置于冰上，取总RNA 2 μL+引物(随机六聚体)1 μL+去离子水9 μL于PCR反应管中，轻轻混匀，在PCR反应仪中70℃静置5 min；放置冰上，依次加5×Buffer 4 μL, Rnase抑制剂1 μL和dNTP 2 μL，轻混匀，25℃ 5 min；立即冰浴后加入反转录酶1 μL（终体积20 μL），轻混匀后依次进行25℃ 10 min, 42℃ 60 min, 70℃ 10 min和立即冰浴. 取cDNA进行PCR. 1.2.4PCR