反义c┐myc寡核苷酸抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖论文.docVIP

　　反义c┐myc寡核苷酸抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖论文 .freelyc基因;反义核酸;大鼠;平滑肌 摘 要:目的 观察反义c-myc寡核苷酸对大鼠气道平滑肌增殖的抑制作用. 方法 大鼠气道平滑肌细胞原代培养，4～12代用于实验.利用Lipofectin将正义、反义及错配c-myc寡核苷酸导入大鼠气道平滑肌细胞，MTT法检测不同寡核苷酸对大鼠气道平滑肌细胞增殖的抑制作用，RT-PCR检测c-myc mRNA的表达，免疫组织化学染色检测c-Myc蛋白的表达. 结果 反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠气道平滑肌细胞增殖，且这种抑制作用呈浓度依赖性;反义c-myc寡核苷酸可降低c-myc mRNA的表达，同时降低了c-myc mRNA的翻译. 结论 反义c-myc寡核苷酸可抑制大鼠气道平滑肌的增殖. Keyyc;oligonucleotide.freeluscle，smooth Abstract:AIM To observe the antiproliferative effect of c-myc antisense oligonucleotide on rat airooth muscle cells.METHODS Rat airooth muscle cells ary cultured.4～12passages ents.Lipofectin ismatched oligonucleotide for c-myc to rat airooth muscle cells.The antiproliferative effect yc mRNA.c-Myc munohistochemistry staining.RESULTS Antisense oligonucleotide for c-myc could inhibit the proliferation of rat airooth muscle cells，and this effect yc could de-crease the expression of c-myc mRNA.The translation of c-myc yc could inhibit the proliferation of rat airooth muscle cells. 0 引言 气道重塑（airodelling）在哮喘发病过程中有重要作用，包括气道上皮和气道平滑肌细胞（airooth muscle cells，ASMC）的增殖［1］ .原癌基因是各种细胞内信号转导的最后共同通道，是参与气道重塑的重要因素.我们拟利用反义c-myc寡核苷酸阻断细胞增殖，达到抑制ASM增生、缓解气道重建的目的. 1 材料和方法 1.1 材料 主要试剂及仪器:Ⅳ型胶原酶、兔抗鼠actin抗体、MTT:Sigma公司;DMEM，Lipofectin，TRIZOL:Gibcobrl公司;胎牛血清:杭州四季青生物制品工程公司;Access RT-PCR试剂盒:Promega公司;核酸水平电泳仪:美国BIO-RAD公司;反义、正义及错配c-myc寡核苷酸由美国Genemed Synthe-sis，Inc.合成，其核苷酸序列分别如下:5’CAC GTT GAG GGG CAT3’，5’CAC GTG GAG TGG CAT3’和5’ATG CCC CTC AAC GTG3’，每条寡核苷酸的末端两个碱基间行硫代修饰.另合成5’端FITC标记的反义c-myc寡核苷酸. 1.2 方法 1.2.1 大鼠ASMC的分离与培养 健康、雄性SD大鼠1只（第四军医大学实验动物中心提供），体质量260g，脊椎脱臼法处死，无菌剥离气管及气管内、外膜，剪碎剩余组织块约为1mm×1mm×1mm大小，2g L-1 Ⅳ型胶原酶37℃消化2次，每次30min，中间吹打组织块1次，100目不锈钢滤网过滤.100mL L-1 胎牛血清高糖DMEM培养. 1.2.2 ASMC的纯化 经原代培养后，细胞呈多克隆生长，选择细胞形态呈梭形的克隆在倒置显微镜下机械分离.分离所得细胞继续培养1代，2.5g L-1 胰酶短暂消化，1∶3传代，静置细胞30min，去除未贴壁细胞，利用平滑肌细胞容易贴壁的特性进一步纯化所得细胞. 1.2.3 大鼠ASMC的鉴定 ASMC离体培养时呈梭形，有较长的突起，细胞核位于细胞中央，排列成旋涡状、放射状或栅栏状.培养细胞经SABC免疫组织化学鉴定.取4～12代于对数生长期的细胞用于实验. 1.2.4 反义c-myc寡核苷酸导入细胞的证实 按1×107 L-1 接种细胞，48h后导入FITC标记的反义c-myc寡核苷酸（2mg L-1 ），继续培