半夏种质资源的随机扩增多态性DNA技术分析论文.docVIP

　　半夏种质资源的随机扩增多态性DNA技术分析论文 .freelplasm resources of Pinellia ternata on molecular level. Methods The geic diversity of P. ternata 21 different populations arkers. Results A total of 162 products plified by 29 10-mer arbitrary primers, 123 (75.9%) products orphic. The results revealed the abundant geic diversity in P. ternata 21 different populations. The cluster analysis using UPGMA method shouch geic diversity on molecular level among the germplasm resources of P. ternata. RAPD markers could be effective tools to construct DNA fingerprintings of P. ternata. Key amplified polymorphism DNA,RAPD)是以PCR为基础的快速简便的分子标记技术,因其费用不高,DNA用量少、不需预知研究对象的基因组序列、PCR引物无种属限制等优点,目前已应用于人参2、石斛3等药用植物的遗传多样性研究。本研究选取了21个野生半夏居群进行了RAPD-PCR扩增分析,构建遗传聚类树状图对半夏居群间的遗传关系进行了研究,旨在探讨其居群间的遗传关系,为半夏种质资源的保护、合理开发利用和新品种选育提供有价值的资料,也为半夏药材DNA指纹图谱的构建奠定一定的基础。 1 材料与方法 1.1 药材 采自四川、重庆及陕西等地不同地点,共21份。来源详见表1。 1.2 DNA的提取 取每一居群10～15不同单株新鲜叶片约0.3 g,经消毒和洗净后,放在乳钵中加入600 μL氯仿于室温下研磨成匀浆,然后加入1.5 mL SDS抽提液100 mmoL/L Tris-HCl(pH 8.0)；100 mmol/L EDTA(pH 8.0)；0.5 mol/L NaCl；1.5%(yCyclerTM PCR仪上进行。反应总体积25 μL,内含1×PCR buffer,1.5 mmol/L MgCl2,1 U Taq酶,0.25 μmol/L引物；100 ng模板DNA,dNTPs各0.2 mmol/L。扩增前94 ℃预变性3 min,每循环在94 ℃变性1 min,36 ℃退火1 min,72 ℃延伸2 min,共45个循环,完成最后一个循环后,在72 ℃保温10 min,然后在4 ℃保存。扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳分离。溴化乙锭染色,凝胶成像仪上观察照像、记录。 1.4 统计学方法 RAPD扩增产物按条带有无分别赋值,有带记为1,无带记为0。利用软件POPGENE处理得到遗传相似系数(Geic Similarities, GS)4。利用GS按不加权成对群算术平均法(unethod etic average, UPGMA)进行聚类。统计分析在NTSYS pc5软件系统下进行。 表1 供试的半夏来源（略） 2 结果与讨论 2.1 扩增片段多态性 RAPD扩增结果表明：29个引物中有28个(96.6%)引物的扩增产物具多态性。图1为引物S20的扩增结果。29个引物共得到162条扩增DNA片段,平均每个引物可获得5.6个DNA片段, 其中123条具有多态性,占75.9%。表明半夏种质资源多态性水平较高,充分体现了半夏不同居群间的遗传多样性。 2.2 遗传相似系数 半夏21个不同居群的遗传相似系数值见表2。从中可见,半夏不同居群间的GS分布较广,范围为0.592 6～0.895 1,说明其遗传背景较复杂,表明其遗传多样性相对较丰富。PT0002居群的半夏与PT0009居群的半夏相似系数最大,高达0.895 1,说明它们的亲缘关系最近。另外,PT0002居群的半夏与PT0054居群的半夏相似系数最小,为0.592 6,说明它们的亲缘关系较远。表2 21个半夏居群遗传相似系数值（略） 2.3 供试材料的聚类分析结果 将21个居群材料RAPD的扩增结果,利用POPGENE软件得到的遗传相似性系数数据,再利用NYSYS pc软件进行各品种间UPGMA聚类分析,构建聚类分析图(见图2)。 从聚类图可以看出,在遗传相似系数0.68处,所有材料可以划分成3组,即Ⅰ组：居群