如何设计PCR引物介绍.PDFVIP

如何设计 PCR 引物 如何设计 PCR 引物 查找目的基因序列并不能直接用于我们研究所用，因为查找到的基因序列只能算是基因 的电子序列，并不是我们研究要用的现实中的序列，如何获得现实的基因序列呢？这就需要 我们根据基因的电子序列来设计引物了，通过引物借助 PCR 方法才能获得我们的目的基因 序列。接下来，我们将介绍一下 PCR 方法并讲述如何设计引物。 PCR （polymerase chain reaction ），即聚合酶链反应，又称基因体外扩增技术，是由一对 引物介导、能在体外对特定 DNA 片段进行快速酶促扩增的技术。PCR 能把很微量的遗传物 质在数小时内扩增数百万倍达到检测水平．使原来无法进行分析和检测的许多项目得以完 成。PCR 引物设计的目的是找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板 DNA 序列。 引物的优劣直接关系到 PCR 的特异性与成功与否。对引物的设计不可能有一种包罗万象的 规则确保 PCR 的成功，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。 1.引物的特异性 引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 70%或有连续 8 个互补碱基同源。 2.避开产物的二级结构区 某些引物无效的主要原因是引物重复区 DNA 二级结构的影响，选择扩增片段时最好避 开二级结构区域。用有关计算机软件可以预测估计 mRNA 的稳定二级结构，有助于选择模 板。实验表明，待扩区域 自由能 （△G° ）小于 58.6lkJ/mol 时，扩增往往不能成功。若不能避 开这一区域时，用 7-deaza-2 ′-脱氧 GTP 取代 dGTP 对扩增的成功是有帮助的。 3.长度 寡核苷酸引物长度为 15~30bp，一般为 20~27mer。引物的有效长度：Ln=2 （G+C ）+ （A+T ） Ln 值不能大于 38，因为38 时，最适延伸温度会超过 Taq DNA 聚合酶的最适温度 （74℃), 不能保证产物的特异性。 4.G+C 含量 G+C 含量一般为 40%~60% 。其 Tm 值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50% 寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于 Tm 值 5~10℃。若按公式 Tm=4 （G+C ） - 10 - 汉恒生物科技(上海)有限公司 400-092-0065 地址：上海市徐汇区斜土路 1175 号景泰大厦 1503 021 实验室：上海市张江高科技园区张江药谷孵化器 1 号楼 314 汉恒生物科技 邮箱：service@ 如何设计 PCR 引物 +2 （A+T ）估计引物的 Tm 值，则有效引物的 Tm 为 55~80℃，其 Tm 值最好接近 72℃以使复 性条件最佳。 5.碱基随机分布 引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3 ′端不应超过 3 个连续的 G 或 C，因这样会使引物在 G+C 富集序列区错误引发。 6.引物自身 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级 结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不 能大于 3bp。 7.引物之间 两引物之间不应有互补性，尤应避免 3 ′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引 物间不应多于 4 个连续碱基的同源性或互补性。 8.引物的 3 ′端 引物的延伸是从 3 ′端开始的，不能进行任何修饰。3 ′端也不能有形成任何二级结构 可能，除在特殊的 PCR （AS-PCR）反应中，引物 3 ′端不能发生错配。 在标准 PCR 反应体系中，用 2U Taq DNA