李萍－关于微生物系统代谢工程为氨基酸生产.ppt-生物化学与分子生物.ppt

李 萍  摘 要 传统上是采用随机突变和筛选的方法提高微生 物生产氨基酸的效率，这样可能使细胞代谢引起 意想不到的生理上的改变。合理的基因组范围内 的代谢工程是以系统和合成生物学的方法为基础 的，被称为系统代谢工程，它被上升为解决这些 问题的方法。目前，一些氨基酸生产商利用系统 代谢工程已经成功的得到了发展，这里的这些代谢工程步骤在系统生物框架中实行，并且整个代谢网路，包括复杂的调控回路，被设计为一个整体的方法。在本文中作者评论了系统代谢工程成功应用于开发氨基酸生产菌株的当前状况和讨论了未来的希望。 前 言 目前年生产氨基酸的产量超过二百万吨。但氨基酸的应用非常广泛，像食品添加剂、医药品、动物饲料添加剂、化妆品和聚合体原料等等。目前一些氨基酸被用作生产生物燃料和抗生素的重要的中间前体。由于氨基酸市场增长迅速而同时竞争越来越大，研究员开始将他们的努力放在提高氨基酸生产效率以达到最高可能的水平。 系统代谢工程是一个理想的开发生产氨基酸和其它产物菌株的方法。在系统代谢工程中，工程目标是通过考虑整个代谢和调控网络以及中游（发酵）和下游（回收和净化）过程来决定的。在实际的代谢工程中，改变这些目标对整个代谢的影响检测到反馈信息。开发代谢工程的反复运作模式是通过以菌株开发为基础的，最终能够获得理想的代谢显型。在这篇文章中，我们简要的介绍了系统代谢工程的工具，概括了最近的一些文献应用系统代谢工程的方法生产氨基酸和提出了未来的前景。 代谢工程（systems metabolic enginerring ) 代谢工程，亦途途径工程和代谢设计，是一门利用分子生物学原理系统细胞谢网络，并通过ＤＮＡ重组技术合理设计细胞途径及遗传修饰，进而完成细胞特性改造的应用性学科，鉴于涉及到多基因的联合协同表达控制机制，与传统的蛋白多肽基因表达以及基因定向突变已有显著区别，故作者将之作为第三代基因工程。 经典模式转向系统工程 经典模式转向系统工程 生产L-缬氨酸的谷氨酸棒状杆菌菌株，Radmacher 等敲除了ilvA 和panBC基因且过量表达ilvBNCD基因。最终改造的菌株能够产生10.6g/L的L-缬氨酸。通过去除乙酰羟酸L-缬氨酸合成酶反馈抑制进一步改善这个菌株，导致L-缬氨酸的产量增加43%。 经典模式转向系统工程 一个L-丝氨酸高产菌株谷氨酸棒状杆菌也通过目标代谢工程构建成功。L-丝氨酸脱氢酶去除的菌株过表达抗反馈抑制的3-磷酸脱氢酶，磷酸丝氨酸转氨酶和磷酸丝氨酸磷酸酶能产生8.2g/L L-丝氨酸。通过减少叶酸供应量来进一步改进谷氨酸棒状杆菌过表达serACB基因能够产生32.8g/L的L-丝氨酸。 经典模式转向系统工程 系统代谢工程工具 基因组学 — 对物种的所有基因进行定位、作图、测序和功能分析。 系统代谢工程工具 系统代谢工程工具 蛋白质组学 — 它旨在阐明生物体内全部蛋白质的表达模式及功能模式，其内容包括蛋白质的定性鉴定、定性检测、细胞内定位、相互作用研究等，最总揭示蛋白质的功能，是基因组DNA序列与基因功能之间的桥梁。 应用系统代谢工程进行氨基酸生产 通过基因组工程结合转录组学分析和基因敲除在硅片上模仿大规模的基因组代谢网络构建了一个有效生产L-缬氨酸的大肠杆菌。不利于L-赖氨酸生产的 像反馈抑制、转录衰减调控的基因被位点特异性基因组工程去除， L-赖氨酸生物合成的竞争路径相关基因去除，ilvBN操纵子被扩增。产量达到0.066g L-赖氨酸 /1g葡萄糖。通过使livJ失活阻止摄入L-缬氨酸以lrp过表达提高L-缬氨酸的产量，livJ负责摄取L-缬氨酸和通过激活ikvIH编码乙醛酸合成酶来提高L-缬氨酸的生物合成。同样通过它与Lrp的协同效应，最近鉴定的L-缬氨酸输出者（ygaZH）大大地减少提高L-缬氨酸产量的难度。为了更进一步的改进，三个基因敲除的变异菌株（DaceF Dmdh DpfkA），预测基因敲除模仿硅片上大规模的基因代谢模型被构建成功了。这个菌株能够使L-缬氨酸的产量达到每克葡萄糖产0.378克L-缬氨酸。 结 论 氨基酸合成路径非常复杂且严格规范。所以微生物不能正常的生产理想水平的氨基酸。传统的方法是采用随机变异和筛选的方法开发氨基酸生产菌株，而现在补充有合理的代谢工程，它成为了生物组学中更加有用的工具已经可以使用了。并且以综合的分析生物组学数据和大规模基因组代谢模型为基础的系统代谢工程允许开发具有清晰基因型的优良菌株。这个方法将来会广泛的应用作为我们理解细胞是一个不断进步的系统。 结 论 尽管在生物信息学和系统生物学去识别复杂的生物组学数据方面取得了巨大的进步 ，但是为了他们完整的分析需要开发新的方法。为了使运算法则在硅片上大规模的代谢和调控网模仿更精确和实际，需要开发最优