拟南芥过表达重点讲义.docVIP

学院：生命科学学院专业：植物学姓名：乔亚飞学号：216021001 OverexpressionofSsCHLAPXsconfersprotectionagainstoxidativestressinducedbyhighlightintransgenicArabidopsisthaliana 盐地碱蓬CHLAPXs基因在拟南芥中过表达可以保护由强光引起的氧化应激 作者：Cai-HongPang,KeLiandBaoshanWang 期刊：PhysiologiaPlantarum 影响因子：3.52 摘要：为了研究抗坏血酸过氧化物酶（CHLAPX）在活性氧清除系统中的作用的重要性，本实验克隆了盐地碱蓬chlapx（sschlapx）编码基质APX（sAPX）和类囊体膜APX（tAPX）。基质sapx 的cDNA由1726个核苷酸组成，其中包括一个1137bp开放阅读框（ORF），编码378个氨基酸。类囊体tapx 的cDNA由1561个核苷酸组成，包括1284bp的开放阅读框，编码427个氨基酸。ss.sapx与ss.tapx 氮端378个氨基酸是相同的，而炭末端49种氨基酸不同。通过农杆菌转化法将apx转入到拟南芥中，用高光（1000μmolm?2?1）处理转基因株系。研究结果表明在强光下，转基因株系的Fv/Fm和叶绿素含量在正常光照下差异较小，但是在强光处理下过表株系均显著高于野生型。这些结果表明，在强光胁迫下，SsCHLAPX对叶绿体中活性氧的清除起着重要的作用。 APX同工酶mitAPX）和微体型APX(mAPX)。chlAPX具有两种类型的同工酶：基质型(sAPX)和类囊体(tAPX)tAPX和豌豆APX基因在烟草中过表达可以降低百草枯对其产生的氧化胁迫(Murgiaetal.2004,Yabutaetal.2002)。烟草中APX基因的过表达无法缓解臭氧产生的胁迫(Torsethaugenetal.1997)。 研究的目的：第一，验证APX酶是否具有清除活性氧的功能；第二，研究APX 在高浓度50%(w/v)甲酰胺缓冲液中,准备使用一个随机引物标记工具32p探针标记DNA。杂交袋至于65℃中洗膜，待印记变干后取出，在-70℃下进行底物显色。 探针对转录结果的分析显示SsCHLAPX放大了以下引物:SsCHLAPX-f（顺序）(5-GTCGTCAAACCCAACCAACCTCCTC-3)andSsCHLAPX-r（逆序）(5-ACTCTTGCCGGATGAATACTTGG-3).探针对转基因拟南芥转录结果的分析显示sAPX/tAPX放大了以下引物Ss.sAPX/Ss.tAPX-f(5-GTCGTCAAACCCAACCAACCTCCTC-3)AndSs.sAPX/Ss.tAPX-r(5-TGCCTCATAGAATCCGACAGCTCAC-3). 拟南芥载体的构建与转化 构建转基因载体，采用GATEWAY技术（一种大规模克隆技术）在CaMV35S启动子的控制下将拟南芥中的整条sAPX和tAPX脱氧核糖核苷酸克隆（整合）到AMBIA1300。利用农杆菌侵染法将质粒载体克隆到拟南芥中。 利用PCR检测转基因 根据Yabuta等的方法从野生型和转基因拟南芥中提取基因组DNA样本，利用以下引物通过PCR扩增tAPXandsAPX当中的100ng的基因组DNA。Ss.sAPX/Ss.tAPX-f(5-GTCGTCAAACCCAACCAACCTCCTC-3) AndSs.sAPX/Ss.tAPX-r(5-TGCCTCATAGAATCCGACAGCTCAC-3.) 制备粗酶提取物 粗酶是根据Rao等人的方法从野生型和转基因拟南芥的叶子中提取。（K-phosphatebuffer和M-phosphatebuffer分别是碱性和中性磷酸缓冲液）1g新鲜的叶子放于4℃的2ml溶液中。50mMl?1的碱性磷酸缓冲液,PH7.8，5mMl?1的EDTA（乙二胺四乙酸）和2mMl?1的AsA。匀浆在4℃下15000转离心15min。测定上清液中蛋白质含量,过氧化氢酶,抗坏血酸过氧化物酶和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。 强光照射处理 18.将转基因和野生型拟南芥的叶子剪下来至于卤钨灯下(1000μmolm?2s?1)照射2h，灯与样品之间加以流动的水来滤除红光来阻止叶子受热。对照组的叶子至于含水的培养皿中在强光90μmolm?2s?1的条件下照射2h。 抗氧化酶实验（分析） 19.过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性的测定分别根据Raoetal.(1997)andGiannopolitis的方法。APX的测定根据JimenezetalandRies(1997)的方法。蛋白质含量的测定根据Bradford(1976)的方法，以牛血