避免RNase酶污染的方法.docVIP

避免RNA酶污染的方法RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后又迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的RNase完全失活。为了获得高质量的真核细胞mRNA，必须使用RNA酶的抑制剂或采用下述的破碎细胞和灭活RNA酶同步进行的方法，最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的RNA酶的活性。同时，避免偶然引入实验室内其他潜在的痕量RNA酶也很重要。下面列举避免RNA酶污染问题的一些注意事项。大多数有经验的研究者并不拘泥于这些注意事项，只是在遇到问题时可能采用其中的一种或几种方法加以解决。我们谨将下述内容作为解决RNA酶污染问题的实验指南。 1．塑料制品：尽可能使用无菌、一次性塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，有些厂家提供的产品已达到RNase-free，可以直接使用，再次处理容易造成二次污染，得不偿失。但原则上国产塑料制品处理后方可使用。处理方法如下： （1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入焦碳酸二乙酯（DEPC）使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC有致癌之嫌，须在通风柜中小心操作。 （2）将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。 （3）在通风柜中37℃或室温下处理过夜。 （4）将EDPC水溶液小心倒入废液瓶中，用铝箔封住含DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。上述处理可以除去器皿上痕量的DEPC，以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。 （5）用合适的温度（80-90℃）烘烤至干燥，置于干净处备用。 2．玻璃和金属制品： 实验室用的普通玻璃和金属器皿经常有RNA酶污染，使用前必须于180℃干烤8小时或250℃烘烤3小时以上。另一种方法是用0.1%的DEPC水溶液浸泡。 3．电泳槽：用于RNA电泳的电泳槽应用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满3%的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用0.1%DEPC处理过的水彻底冲洗电泳槽。最好能留出一些玻璃器皿，塑料制品和电泳槽作上特殊标记，存放在指定地点，为RNA实验专用。 4．移液器： RNase的又一污染源是移液器。根据移液器制造商的要求对移液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗移液器的内部和外部，基本达到要求。移液器金属退头器是RNA酶的一个重要来源，实验前最好取下它。 5．溶液：用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，用干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。可能的话溶液应用0.1% DEPC水于 37℃至少处理12小时，然后于100℃加热15分钟或在15 lbf/in2(1.034×105Pa)的高压下蒸气灭菌30分钟。注：DEPC可与胺类迅速发生化学反应，因此不能用来处理含有Tris一类的缓冲液，可存几瓶新的，未开封的Tris晶体以制备无RNA酶的溶液。 6．研究人员： RNA酶广泛存在于人的皮肤上，最主要的潜在污染源是研究人员的手。因此，在准备分离和分析RNA的材料和溶液时，以及在涉及RNA的一切操作过程中，都应戴一次性手套，接触“脏的”玻璃器皿和其他物品以后，手套就可能沾染上RNA酶，因此进行RNA实验时应勤换手套。