樟树籽蛋白质的提取与分析.ppt

樟树籽蛋白质的提取与分析 08生物 林开鹏 指导老师：李卫林 目录 前言 材料与方法 结果与讨论 结论 前言 1 樟树籽简介 1）外形 樟树籽 ,又名樟梨、香樟大木姜子、樟子等。成熟的樟树籽呈扁球形 ,直径大约5～9mm ,每千粒重大约是 200 g,果皮肉质薄 ,能散发出芬芳的清香 2）药理作用樟树籽有驱风散寒、行气止痛之功效。癸酸(C10)已应用于医药行业合成鱼腥草素等消炎药 ,主要含有癸酸(C10)的樟树籽脂肪油已被试制成碳酸甘油脂 ,用于治疗脂肪代谢紊乱病症 ,并能降血脂及胆固醇。 材料与方法 材料 樟树籽干燥 70摄氏度 24小时，备用 试剂 石油醚（C.P.，沸程30～60℃），磷酸氢二钠（分析纯 AR），磷酸二氢钠（分析纯 AR）， 氯化钠（分析纯 AR），95%乙醇（分析纯 AR），Tris （分析纯 AR），浓盐酸（分析纯 AR） ，SDS（分析纯 AR），甘油（分析纯 AR），溴酚蓝（分析纯 AR），-丙烯酰胺（分析纯 AR），巯基乙醇（分析纯 AR），甲醇（分析纯 AR），考马斯亮蓝R-250（分析纯 AR），冰醋酸（分析纯 AR） 器材 FZ102型植物粉碎机，索氏提取器，离心机，紫外分光光度计，垂直电泳槽，电泳仪，微型凝胶电泳装置（厂家）；水浴锅；Eppendorf管；微量注射器（50μl或100μl）。 实验 提取方法 1）称样 取10g样品装入滤纸斗中，把滤纸斗的开口处折起来封死；防止样品泄出滤纸斗。调整滤纸斗的高度，使其放在抽提管中时略低于虹吸管的上弯头处 2）虹吸 向提取管中倒入石油醚，使其液面达到第一次液面的一半，冷凝管与自来水管相连轻轻打开自来水（冷凝用），将索氏提取仪整个装置放入恒温水浴锅中加热提取（水温80℃左右）提取时间2～2h，约虹吸10次以上 3）回收 取下平底烧瓶，将提取管的下端口插入回收瓶中，倾斜装置，提取管中的石油醚会虹吸而流入回收瓶中，达到回收的目的。再装上平底烧瓶，继续放入恒温水浴锅中加热直至冷凝管下端无石油醚滴下，表明平底烧瓶中的石油醚已经蒸干。注意：必须蒸干后才能放入干燥箱烘干，否则会引起火灾。取下平底烧瓶，回收提取管中的石油醚 4）称量粗脂质量将平底烧瓶放入120℃的电热鼓风干燥箱中烘15min，取出冷却后称重（须戴手套，以免烫伤）。再将平底烧瓶用洗涤剂洗净，于120℃的电热鼓风干燥箱中烘干（约15min），取出冷却后称重，两者的质量之差就是粗脂的质量。 5）蛋白质的溶解 将上述去脂烘干的样品置于烧杯中，加入ph为7.2的磷酸盐缓冲夜100ml浸提2h 蛋白质的分离方法 1 将浸提液均匀倒入两个离心管使两管质量相同，对称放入离心机中，调整离心机4000转 5分钟，将上清液倾入烧杯，加晶体NaCl少许（加速沉淀并使沉淀完全），待溶解后再加入95%的乙醇100ml混匀。观察有无沉淀析出 2 将所得溶液离心，获得沉淀，用1% NaCl溶液溶解定容于250ml容量瓶中，备用。 蛋白质的定性 1茚三酮反应 取1支试管加入蛋白质溶液1毫升，再加0.5毫升0.1％茚三酮水溶液，混匀，在沸水浴中加热1—2分钟，观察颜色 在一小块滤纸上滴一滴0.5％的甘氨酸溶液，风干后，再在原处滴上一滴0.1％的茚三酮乙醇溶液在微火旁烘干显色，观察 2 黄色反应 取一试管，置所提取的蛋白质溶液10滴及浓硝酸3~4滴，加热，冷却后再10%NaOH溶液5滴，观察颜色变化, 蛋白质的等电点 实验步骤： 取同样规格的试营4支,向以上试管中各加 样品蛋白的醋酸钠溶液1毫升,加一管,摇句一管.此时1,2,3,4管的pH值依次为1,3,5,7观察其混浊度.静置10分钟后,再观察其混浊度.最混浊的一管的pH即为样品蛋白的等电点. 紫外光吸收法测定蛋白质浓度 在紫外分光光度计上，将未知的蛋白质溶液小心盛于石英比色皿中，以生理盐水为对照，测得280nm和260nm两种波长的吸光度（A280nm及A260nm）。 将A280nm及A260nm波长处测得的吸光度按下列公式计算蛋白质浓度。 C = 1.45A280nm －0.74A260nm 式中C：蛋白质质量浓度（mg/ml）； A280nm：蛋白质溶液在280nm处测得的吸光度； A260nm：蛋白质溶液在260nm处测得的吸光 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法—蛋白质的分子量测定 实验试剂配制 灌制分离胶 电泳 制备样品和上样 .灌制浓缩胶 考马斯亮蓝染色 结果与讨论 前处理 ? 粉碎后用烘箱对樟树籽进行干燥时，粉末热时湿度较大冷时结冻成固态，可以体现樟树籽中油脂含量较高， 称量樟树籽10.002