应用特异性噬菌体抗体克隆和筛选新的大肠癌抗原基因论文.docVIP

　　应用特异性噬菌体抗体克隆和筛选新的大肠癌抗原基因论文 【关键词】 大肠癌 摘要：目的 构建人大肠癌细胞cDNA表达文库，用抗人大肠癌噬菌体抗体CH209筛选新的大肠癌抗原基因。方法 抽提人大肠癌细胞HRT18的总RNA后分离mRNA，利用SMART(S at 5th end of RNA Transcript)技术合成cDNA，与λTripIEx2载体连接包装成cDNA文库。测定原始文库的滴度和文库重组率，鉴定插入片段的大小，测定扩增文库库容量并鉴定CH209筛选的阳性克隆。结果 原始文库滴度为6.5×106pfu/mL，重组率为97%；插入片段的大小介于0.5-2.0kb之间；扩增文库滴度为1.1×109pfu/mL，筛选后获得 10个阳性克隆.freelan colorectal cancer cell HRT18, a. Methods Total RNA cell HRT18 and mRNA total RNA and then double strand cDNA ary library ined. The length of cDNA inserts ined. Results The primary library consisted of 6.5×106 pfu/mL, and the percentage of rebinant clones plified cDNA library L. Ten positive clones ten different genes. Five of these genes ologous to genes knoology to genes knoainder tight be novel genes by matching in GenBank human CRC cell HRT18 is excellent. Ten positive clones may be novel genes. KEY ART(S at 5th end of RNA Transcript)技术，构建了大肠癌细胞HRT18的cDNA文库，并用抗大肠癌单链抗体CH209对文库进行免疫学筛选及鉴定大肠癌及其相关肿瘤抗原，拟为大肠癌肿瘤疫苗的研制提供候选抗原，也有可能为大肠癌早期诊断提供血清学分子标志物。 1 材料与方法 1.1 材料 总RNA抽提试剂TRIzol为Invitrogen公司产品，SMARTTMcDNA文库构建试剂盒购自Clotech公司，mRNA纯化试剂盒及Packagen Lambda DNA Packing system均购自Promega公司。RPMI1640细胞培养基为华美公司产品，小牛血清购自杭州四季青公司，琼脂糖和细菌培养基均为Gibco/BRL公司产品，余为常规试剂。HRT18人大肠癌细胞株来源于人直肠肛门腺癌组织，为本室保存。采用λTripIEX2载体及大肠杆菌XL1Blue。硝酸纤维素膜购自浙江台洲四甲生化塑料制品厂。抗大肠癌噬菌体人抗体CH209为本室制备。HRP标记的羊抗M13单克隆抗体(HRPantiM13)购自Pharmacia Biotech公司。λTripIEx2插入子筛选引物：5′端引物 5′CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT3′，3′端引物 5′ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC3′。Agarose Gel DNA Purification Kit为上海生工生物工程公司产品。 1.2 大肠癌细胞HRT18 mRNA的提取 人大肠癌细胞株HRT18总RNA抽提按照TRIzol试剂操作说明进行，按每107个细胞加入1mL TRIzol混匀，氯仿抽提、乙醇沉淀和室温干燥后，总RNA溶于无RNase的去离子水中，经紫外分光光度计测定其A260，A280吸光度值鉴定纯度，以浓度为11g/L琼脂糖凝胶电泳证实其完整性后，65℃加热10min后，加入生物素标记的Oligo(dT)探针及可结合生物素的磁珠(SMPMAS)与mRNA杂交形成杂交体，磁性吸附将杂交体从总RNA中分离，经洗脱后溶于无RNase的去离子水中，所得mRNA用于合成 cDNA。 1.3 cDNA的合成及酶切 以纯化的mRNA为模板，用含有SfiⅠ酶切位点的SMART Ⅲ寡核苷酸和CDSⅢ/3′PCR引物合成cDNA第一链，再以CDSⅢ/3′PCR引物和5′PCR引物经LDPCR扩增合成双链cDNA。双链cDNA 经SfiⅠ酶切后，Chroma spin400凝胶过滤柱对cDNA进行凝胶过滤层析，分步收集样品，合并较大的cDNA片段。 1.4 cDNA的包装及文库的扩增 将cDNA与载体λTripIEX2按1∶1比例连接，采