进境百合种球上草莓潜隐环斑病毒的检测方法.pdfVIP

维普资讯 第35卷 第4期 植 物 保 护 学 报 V01．35 No4 2008证 8 月 ACTA PHYTOPHYLACICA SINICA Aug． 2008 进境百合种球上草莓潜隐环斑病毒的检测方法 MethodsfordetectingStrawberrylatentringspotvirus from theimportedlilybulbs 于 翠 杨翠云 周国粱 郑建中 胡永强 (上海出入境检验检疫局，上海 200135) YuCui YangCuiyun ZhouGuoliang ZhengJianzhong HuYongqiang (ShanghaiEntry．ExitInspectionandQuarantineBureau，Shanghai200135，China) 草莓潜 隐环斑 病毒 (Strawberrylatentringspot 件为：94℃预变性3rain后进行94℃变性45s．52oC virus，SLRSV)是蔷薇科果实类作物上的重要病毒 复性45s．72℃延伸45s的35个循环扩增，72℃延 之一，在一些感病草莓品种上，可引起斑驳症状，导 伸 10rain后于4℃保存。 致品种衰退和品质、产量的严重损失 。SLRSV 1．4序列测定与分析 能侵染种子、种球、块茎和苗木等，还可随无性繁殖 PCR产物经电泳后，胶纯化回收 目的片段。序 材料的贸易进行远距离传播。我国目前尚未见其发 列测定委托上海基康生物技术有限公司完成。同源 生危害的纪录，是我国的对外检疫性有害生物之一。 性比较利用 GenBank中Blast程序及 DNAStar软件 因此，建立 快速、准确 的病毒检测 方法是 防止 的ClustalW程序进行。 SLRSV传人我国的有效手段。本研究利用 SLRSV 1．5指示植物接种 的双抗体夹心酶联免疫吸附法 (DAS—ELISA)、免疫 将病毒粗提液摩擦接种于本氏烟、昆诺藜、三生 吸附电镜和RT—PCR等检测方法，从荷兰进境百合 烟。接种后的植株置于温室培养，定期观察发病症 种球中检测 SLRSV。 状。接种试验在上海出入境检验检疫局检疫隔离苗 1材料与方法 圃进行。 1．1材料 2 结果与分析 从荷兰进境的感病百合种球及隔离种植期间表 2．1 DAS—ELISA检测 现矮化症状 的百合种苗。碱性磷酸酶标记 的 对从荷兰进 口的8个品种百合种球样品进行 SLRSV多克隆抗体，Agida公司。 DAS．ELISA粗筛，品种为 siberia的样品对 SLRSV多 1．2双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS—ELISA)及免 抗血清呈阳性反应，进一步对 siberia品种的30个种 疫吸附电镜 球进行DAS．ELISA复检，其中6个种球呈 阳性反 参照于翠等 的方法进行。 应，阳性率达20％。 1．3反转录聚合酶链式反应 (RT．PCR) 2．2 免疫吸附电镜 根据GenBank中已公布的SLRSVCP基因的保 利用 “诱捕法”对 ELISA检测阳性的样品进行 守序列设计了2对特异性引物 Ll(5．GCACGTGC． 免疫吸附电镜观察，从 ELISA检测阳性的