第6章 分子物学技术.pptVIP

4、杂交 来源不同的两条单链核酸分子通过碱基互补形成异源双螺旋分子，称为核酸分子杂交。 杂交可分成：DNA与DNA、RNA与RNA、DNA与RNA之间的杂交。 核酸分子杂交技术：使已知序列的DNA或RNA片段上带上可检测的标记，可用来检测样品中未知的核酸序列。 探针浓度、长度、复杂性：探针浓度越高，复性速度越快。但双链探针浓度过高会增加自我复性而影响杂交；浓度过高也会增加非特异结合，使杂交背景增强。探针越长扩散速度越慢；复杂性越高，配对难度也增大。 离子强度：高离子强度溶液中，有利于杂交分子形成。 影响核酸分子杂交的因素 温度：通常在低于Tm 20-25℃的温度下进行杂交。 添加剂：硫酸葡聚糖、聚乙二醇、聚丙烯酸可吸附DNA探针，使DNA接触面增大，而加速杂交反应。 杂交液中的甲酰胺。甲酰胺可降低核酸杂交的Tm。含30%—50%甲酰胺的杂交温度能降低到30—42℃。较低的杂交温度，使探针更稳定，并能更好地保留非共价结合的核酸。 4、预杂交 为了减少探针与广泛存在的非互补核酸的非特异性结合，在杂交前可用封闭物将这些非特异位点封闭。在杂交前的这些处理过程称为预杂交。 常用于预杂交的封闭物 变性的非特异性DNA：常用鲑鱼精子DNA或小牛胸腺DNA。当与滤膜一起孵育后，除滤膜上已吸附样品DNA的区域外，它们可被吸附到所有其它区域，使整个背景覆盖一层。由于它们与探针无同源性，在杂交