第十章 蛋白质氨基酸的测定.ppt

1．原理： 利用蛋白质的特有基团 │ R （— NH—CH—CO） 对紫外光有吸收作用，在280 nm下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系，求含量。 （五）、紫外吸收法 2．适用范围： 常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。 3．主要仪器： ① 紫外分光光度计； ② 离心机：3000-5000 r/min 4．操作：用凯氏法测定标样做标准曲线。 第五节 氨基酸的定性测定 第六节 氨基酸定量测定 1. 原理： 氨基酸本身有碱性 （-NH2-），又有酸性（-COOH），成中性内盐，加入甲醛溶液后，与-NH2-结合，碱性消失，再用强碱来滴定-COOH基。 2．特点： 适用于发酵工业，如发酵液中含氮量，其发酵过程中氮量减少情况等。适于食品中游离氨基酸的测定。 一．氨基酸的一般定量测定 （一）甲醛滴定法 3．双指示剂： ① 40%中性甲醛溶液：以百里酚酞作指示剂，用 氢氧化钠将40%甲醛中和至蓝色。 ② 0.1%百里酚酞乙醇溶液； ③ 0.1%中性红50%乙醇溶液； ④ 0.1 mol/L 氢氧化钠标液。 （一）甲醛滴定法 （一）甲醛滴定法 4. 操 作 （二）茚三酮的比色法 原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可比色定量。 二．个别氨基酸的定量测定 8种氨基酸的定量测定方法：P147 一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。 第七节 氨基酸的分离与测定 一．薄层色谱法：薄层层析法（TLC 法） 取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。 （一）原理 Rf = a/b 样点 a b 溶剂前沿 点样原点 （二）优、缺点 （三）操作方法：P155 ① 薄层板制备 ② 样品液制备 ③ 点样：距薄板底端2 cm处，用针画一标记作为原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时展开，点与点之间间隔1～2 cm。 a.可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注意要等一个点干了再点另一个点。 b.用一小直径ф3 mm 滤纸片，浸入样液，埋到板子上先挖好一个小洞穴。 （三）操作方法 ④ 展开：点样完了，放入密闭容器中（展开槽），倾斜一定角度10～30°，下端浸入展开剂1 cm，千万别让溶剂浸过了样点。到离顶端一部分，取出样板、晾干、显色。 a.展开剂的有关情况：主要是低沸点的2～3种有机溶剂组成的溶剂系统，分离效果主要决定于展开剂的选择，因为吸附剂在一定情况下是恒定的，吸附剂的选择余地远远小于展开剂的选择。 b.展开剂的选择方法： Ⅰ.微量圆环法; Ⅱ.用小载波片试验，微量展开剂展开5 cm; Ⅲ.图解法： 样品极性小，选吸附剂活性高，展开剂极性低的。 样品极性大，选吸附剂活性低，展开剂极性高。 有机溶剂极性由小到大为： 石油醚、环己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、有机酸类等。 ⑤ 显色： a.喷适当的溶液，使斑点显色，即喷雾显色。 b.喷有荧光反应的物质，在紫外光下观察斑点。 c.将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察。 （涂板时把荧光指示剂加入到固体吸附剂中） 定性：在同一块板上，同等条件下操作，被测样与标准样同时展开、显色，同 Rf 值或查手册找相同的Rf值。 定量： a.目视定量法：以标准斑点对照，相当于样品斑点中含量ug数。 b.斑点面积定量法。 c.将样点取下来，定容，离心，比色。 d.利用薄层色谱扫描仪： 例：日本岛津 CS—910型双波长薄层色谱扫描仪 离心薄层色谱仪： 1. LBG—1型离心薄层色谱仪，北京产； 2. 7924型离心薄层色谱仪，美国Harrison 公司研制； 3. CLC—5型离心制备液体色谱仪（日本日立公司，带紫外检测器、记录器和自动收集器，制备量可达10 g）。 二．氨基酸自动分析仪法 三．气相色谱法 四．高效液相色谱法 全自动氨基酸分析仪 10-3 第十章 重 点 凯氏定氮法原理、分步、测定方法。 双缩脲法测定原理。 氨基酸总量的测定方法（甲醛滴定法）。 TLC法原理、方法，Rf值的作用及计算方法。 * * （GB