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　　成体半月板细胞体外分区培养研究论文 【摘要】 目的 分区培养成体半月板细胞，观察不同区域的半月板细胞生长特性以及生长因子对其的影响。方法 无菌切取1月龄雄性山羊双后肢半月板，剪碎后DHanks液漂洗，Ⅱ型胶原酶振荡消化，滤网过滤后离心收集细胞。接种6孔细胞培养板，每孔1×105个，37 ℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度培养。绘制生长曲线，台盼蓝染色测细胞活力。细胞爬片行苏木精伊红及Ⅱ型胶原免疫组化染色。RTPCR检测aggrecan的表达。用流式细胞仪检测细胞周期的分布。结果 山羊成体半月板细胞自36 h后开始贴壁.freelorphology of cultured meniscal fibrochondrocytes in different areas and the influence of groenisci both hindlimbs of onemonthold male goat under sterile condition, cut into pieces, rinsed idity. Trypan blue stain and immunohistochemistry stain of type Ⅱ collagen ine the vitality of the cells. Reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) etry to analyze the distribution of the cell cycle. ResultsMeniscal fibrochondrocytes adhered to the disk 36 hours after inoculation. The peripheral cells ostly fusiformed, the central cells polygonal and the cells in betixed. Trypan blue failed to stain the cells. After adding hIGFⅠ and bFGF to the medium, more polygonal cells etry study shoeniscal chondrocytes in the S stage increased, munoreactive product of type Ⅱ collagen munohistochemistry and the existence of aggrecan band proved by RTPCR. ConclusionThe morphology of cultured meniscal fibrochondrocytes eniscus, tibial; insulinlike grom3大小碎块，加入2.5 g/L胰蛋白酶和2 g/L的Ⅱ型胶原酶，37 ℃振荡消化，离心收集细胞，加入含体积分数0.10的FBS、105 U/L的青霉素钠、105 g/L链霉素的DMEM培养液重悬细胞。血细胞计数板法行细胞计数后，按1×105个／孔接种于6孔板。37 ℃、体积分数为0.05的CO2、饱和湿度培养。隔日换液1次，用倒置相差显微镜观察细胞生长情况，当长至70％～80％融合时消化传代培养。在条件培养液中分别加入终浓度为60 μg/L的bFGF和终浓度为100 μg/L的hIGFⅠ。 1.2 细胞生长特性检测 1.2.1 台盼蓝拒染试验检测细胞活性 将细胞稀释至1×109/L，取9滴细胞悬液移入小试管中，加入1滴4 g/L台盼蓝溶液混匀。在3 min内计数活细胞和死细胞，死细胞被染成蓝色。计算活细胞率：活细胞率=（活细胞总数/计数细胞总数）×100%。 1.2.2 测定细胞群体倍增时间（PDT） 在接种时和接种后不同时间进行细胞计数，按下述公式计算PDT：PDT＝｛log 2/（log Ntlog N0）｝×t，其中N0、Nt分别代表接种时和培养t h后的细胞数。 1.2.3 生长曲线的描记 接种24孔培养板，分8组，每组3孔，每日计数1组，共8 d。以培养时间为横轴，细胞数量为纵轴（对数），描绘在半对数坐标纸上，连成曲线。在曲线上细胞数量增加1倍的时间为细胞倍增时间。 1.3 细胞爬片苏木精伊红染色及Ⅱ型胶原免疫组化染色 半月板细胞传代时接种于预先放入无菌盖玻片的6孔板内，长至60％～70％融合后行苏木精伊红染色和Ⅱ型胶原免疫组化染色。 1.4 RTPCR检测aggrecan的表达 TRIZOL法提取加入生长因子培养的半月板细胞的总RNA，行RNA电泳观察28S和