中药对日本血吸虫病肝纤维化形成的影响论文.docVIP

　　中药对日本血吸虫病肝纤维化形成的影响论文 .freelL浓度的水溶液，以备灌胃用。 1.3.2 吡喹酮购自北京紫竹药业有限公司（批号 1.3.3 第一抗体兔抗鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1多克隆抗体为武汉博士德公司分装的美国SantaGruz生物技术有限公司产品，效价均为1∶200。 1.3.4 免疫组化SABC试剂盒由正常血清封闭液、第二抗体（羊抗兔IgG）、SABC（链霉亲和素生物素过氧化物酶复合物）液、抗原修复液、复合消化液组成。DAB显色试剂盒，由试剂A（3、3二氨基联苯胺浓缩液）、试剂B（H2O2浓缩液）、试剂C（TBS）浓缩缓冲液组成。以上两试剂盒均购自武汉博士德公司。 1.4 用药方法 1.4.1 吡喹酮感染尾蚴第七周，以100mg/kg剂量每天给予吡喹酮杀虫治疗，用药6d。 1.4.2 中药制剂于感染尾蚴第八周开始，治疗组给予中药制剂灌胃，2次/d，1mL/只。正常对照组及感染对照组用生理盐水灌胃，1mL/只，2次/d。 1.5 取材 于感染第12周最后一天断颈放血处死，立即取肝脏，切成大小约2.0cm×1.0cm的组织块，置低温冰箱中保存备用。 1.6 Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1的检测 肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1的检测均采用免疫组化SABC法。简述之：将冷冻保存的肝脏冰冻切片，吹干、纯丙酮固定30min，室温干燥。1.5%双氧水/甲醇液处理10min，以灭活内源性过氧化物酶。加正常山羊血清封闭液，室温10min。分别滴加按1∶200稀释的第一抗体（兔抗鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1），37℃，2h。PBS洗净后，滴加生物素化的羊抗兔1Gg，37℃，20min，PBS洗涤后加链酶亲和素生物素过氧化物酶复合液，37℃，20min，PBS洗5min×4次。加DAB显色试剂盒中试剂A、B、C各1滴，混匀后加至切片，室温显色，镜下控制反应时间（一般10min）。常规洗净，甘油明胶封片。 1.7 结果判定 1.7.1 显微镜下的结果判定对Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1先行显微镜下观察，了解阳性目标的分布和形态，并对上述3组的阳性结果进行镜下对比分析。 1.7.2 计算机读片定量分析对Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1进行计算机读片，使用计算机MPZAS500多媒体彩色病理图文分析系统进行定量分析。每张切片选择最大的虫卵肉芽肿进行读片，统计场总面积为262144μm2，先对阳性目标进行颜色标定，然后计算机阳性目标面密度Aa（阳性目标占统计场总面积的百分比）。 1.8 统计分析 均数以x±s表示，组间差异比较用t检验，相关性研究采用Spearman等级相关分析。 2008年8月赵建玲等：中药对日本血吸虫病肝纤维化形成的影响第4期2008年8月河北北方学院学报（医学版）第4期 2 结果 2.1 Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1免疫组化的显微镜观察结果 镜下见感染未治组肝内虫卵肉芽肿呈不规律圆盘状，其内可见数量不等的虫卵及密集片状的棕黄色着色，为Ⅰ、Ⅲ型胶原。虫卵肉芽肿附近的肝小叶叶间膈处亦有明显Ⅰ、Ⅲ型胶原着色，呈条索状。治疗组肝内虫卵肉芽肿普遍较感染对照组小，虫卵肉芽肿内的胶原分布亦较感染对照组减少。正常对照组肝内无虫卵肉芽肿，亦无胶原着色。 感染未治组肝内TGFβ1呈棕黄色，片状，分布于虫卵肉芽肿内，与Ⅰ、Ⅲ型胶原的分布基本一致。但虫卵肉芽肿附近的肝小叶叶间膈处一般未见TGFβ1阳性着色。治疗组肝内TGFβ1阳性着色较少。正常对照组肝内未见TGFβ1阳性着色。 2.2 计算机定量分析Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1的变化 治疗组、感染未治组肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1免疫组化检测结果经计算机MPZAS500多媒体彩色病理图文分析系统定量分析的结果见表1。 表1 肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1的定量分析 经统计学分别处理两组大鼠肝内Ⅰ、Ⅲ型胶原及TGFβ1的阳性目标面密度均值，治疗组均显著低于感染对照组（P 0.05）。经等级相关分析，无论是治疗组，还是感染未治组，肝内的Ⅰ型胶原与TGFβ1阳性目标面密度值呈显著正相关关系（分别为r=0.9534，P 0.05；r=0.8667，P 0.05）；Ⅲ型胶原与TGFβ1阳性目标面密度值也呈显著正相关关系（分别为r=0.9626，P 0.05；r=0.9272，P 0.05）。 3 讨论 肝脏纤维化是肝细胞损伤严重而再生不足情况下形成的，细胞因子尤其是转化生长因子作用于肝细胞、贮脂细胞，合成过量的胶原等细胞外基质，引起肝纤化，最终导致肝硬化。因而保护肝细胞，减少胶原纤维的形成是防止肝纤维化的重要环节。干扰素对转化生长因子具有拮抗作用，因而阻抑纤维化的形成3。研究发现4，正常动物肝脏RNA能降低血吸虫病肝