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　　中药对镍暴露氧化损伤抑制作用论文 吕晓云，蒲晓丽，陈静，朱玉真，赵健雄，魏虎来 【摘要】 目的 研究灌服中药扶正解毒汤(FJD)后兔血清对硫酸镍(NiSO4)暴露的人支气管上皮细胞(16HBE)自由基含量及8羟基2脱氧鸟苷三磷酸酶(8oxodGTPase)表达的影响。方法 体外培养的16HBE细胞分别经NiSO4暴露及NiSO4加扶正解毒汤含药血清共同处理后，采用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)及实时荧光定量RTPCR检测自由基含量及8oxodGTPase表达的变化。结果 NiSO4(800μmol/L)暴露的16HBE细胞，其自由基含量及8oxodGTPase表达水平均高于NiSO4与扶正解毒汤(10%)共处理组细胞.freell的溶液，高温高压消毒灭菌，密封，4℃以下储存备用。 113 主要试剂及设备 基础培养液(MEM)培养基、Trizol试剂盒(美国GIBCO公司)；小牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；乙酰乙酸盐2，7二氯氢化荧光素(D399)(美国Molecular Probes公司)；ExScripＴＭRT reagent Kit及SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(日本TaKaRa公司)；TCS sp2型激光扫描共聚焦显微镜系统(德国Leica公司)；Smart Cycler ⅡSystem荧光定量PCR仪(美国PE公司)。人类human NutT homologue (hMTH1)基因PCR引物设计参照文献〔３〕。分别为P1：5′CTTCTCTGCGCCACTCAA3′，P2：5′GAGCGGCGGTGCAGAACC3′；预计扩增片段177bp。βactin引物为P1：5′TTGCGCTCAGGAGCAAT3′，P2：5′TTCCAGCCTTCCTTCCTGG3′；预计扩增片段223bp(宝生物工程有限公司合成)。 12 方法 121 扶正解毒汤血清冻干粉制备 以中药扶正解毒汤12g/kg每天分2次给兔等体积灌胃，空白对照组予以生理盐水(灌胃前均禁食，自由取水)，共3d。于末次灌胃后2h心脏采血，按文献〔4〕方法制备扶正解毒汤血清及空白血清冻干粉。 122 细胞培养及受试物处理 16HBE细胞用含10%小牛血清、青霉素及链霉素的MEM培养基于37℃，5%CO２饱和湿度的环境中培养。试验时以不含小牛血清的MEM培养液将细胞调至1×104/ml，按以下分组分别处理：(1)NiSO4组：NiSO4以无血清MEM培养液溶解，终浓度800μmol/L(预试验中，NiSO4≥800μmol/L时，细胞存活率骤降至60%以下，故以800μmol/L作为此试验浓度)。(2)扶正解毒汤+NiSO4Ⅰ组：NiSO4染毒前4h加入扶正解毒汤血清，终浓度为10%(体积分数)，再加入NiSO4(800μmol/L)。(3)扶正解毒汤+NiSO4Ⅱ组：同时加入扶正解毒汤与NiSO4。(4)空白血清对照(简称空白血清)+NiSO4组：同时加入空白血清与NiSO4。终浓度均同(2)。(5)空白血清组：加入空白血清(10%)。(6)阴性对照组：MEM培养液。 123 细胞存活率检测 以常规台盼蓝计数法检测各组细胞存活率，每组共计数250个细胞。 124 细胞内自由基含量检测 在加入NiSO416h后，将收集的各组细胞制成细胞悬液，取D399(5μg/ml)1ml，加至各细胞悬液中，按文献〔5〕方法以激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)检测16HBE细胞内自由基含量(以平均荧光强度表示)。 125 RNA提取、cDNA合成及标准定量模板的制备 在进行自由基含量测定的同时，另收集各组细胞，按Trizol试剂盒说明，提取各组总RNA，测定A260，A280的吸光度值，计算出RNA的含量，并按ExScriptTMRT reagent Kit操作说明逆转录合成cDNA,置于-80℃保存备用。将宝生物工程有限公司构建的hMTH1及βactin定量PCR标准品质粒利用各自的引物进行RT-PCR扩增，制备6个不同浓度的标准模板，分别定义为101～106拷贝数/μl，-20℃保存备用。 126 SYBR GreenⅠ实时定量PCR反应 根据SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒说明，设定反应扩增条件，将6组实验样品与不同浓度的标准模板同时进行PCR。重复3次。将检测的临界点设定在扩增过程中，荧光信号由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环数(threshold cycle,CT)作为模板初始浓度的间接指标，将不同浓度的标准模板拷贝的对数相应的CT值作图，得到标准曲线。 127 8oxodGTPase(hMTH1 mRNA)表达的