生物分子的分离纯化2013-10-10刘珍.ppt

5. 增溶剂 样品溶解的程度会影响靶蛋白的产率，在等点聚焦时造成某些蛋白质的沉淀，减少转移到第二相电泳的蛋白质数量。 6. 蛋白酶抑制剂（pronase inhibitor） 裂解细胞提取蛋白质的同时，会释放多种蛋白酶，需要迅速有效抑制它们的活性保持靶蛋白的完整性。 7. 蛋白质的环境因素 ①表面效应的影响 蛋白质的稀溶液容易使蛋白质变性失活，加入高浓度的其他蛋白质如牛血清蛋白(BSA)来防止。 ②温度的影响 低温 ③储存 冻干粉末保存；保存的蛋白质中加入甘油，白蛋白等惰性稳定剂，降低溶液的极性，形成疏水环境，有利于蛋白质的长期保存。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 四、生物小分子的提取纯化 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 1、溶剂提取法 2、水蒸气蒸馏法 3、升华法 4、超临界流体萃取法 5、超声提取法 6、固相萃取法 常用提取方法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 分离精制的原理主要是根据： 1）物质溶解度差别； 2）物质在两相溶剂中的分配比不同； 3) 物质的吸附性差别； 4）物质分子大小差异等进行分离 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 常用纯化方法 液-液萃取法 1、逆流分配法（CCD） 2、液滴逆流色谱法（DCCC） 3、高速逆流色谱法（HSCCC） 4、气液分配色谱（GC或GLC） 沉淀法 1. 溶剂沉淀法 2. 酸碱沉淀法 3. 盐析法 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 分子大小 1. 透析法 2. 凝胶过滤法 3. 超滤法 物质吸附性差别 1. 硅胶吸附色谱 2、氧化铝吸附色谱 3. 活性碳吸附色谱 4. 聚酰胺吸附色谱 5. 大孔吸附树脂吸附色谱 6. 柱层析法 * Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 蛋白质分离纯化的总目标是增加制品的纯度（purity）或比活性（specific activity），以增加单位蛋白质重量中靶蛋白的含量或生物学活性（比活常以活力单位数/毫克蛋白质表示），即从蛋白混合物中设法去除不要的杂蛋白和变性的靶蛋白，使靶蛋白的产量达到最高值。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 蛋白质分离纯化的一般技术路线 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 分离纯化的总体原则 一是保证靶蛋白结构的完整，防止降解和活性蛋白质的变性； 二是尽量满足研究与诊断对靶蛋白纯度的要求。纯化蛋白质总是希望纯度和产率均高，例如纯化某种酶，理想的结果是比活力和总回收率均高，但实际工作中二者不能兼得，通常在科研上希望比活力尽可能高，而牺牲一些回收率，在工业生产和分子诊断中则正相反。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 蛋白质分离纯化的条件 蛋白质是一类结构复杂、有生物活性的生物大分子，离开天然的存在体系，其结构与活性变得极不稳定，因此从生物材料中提纯各种靶蛋白均需要特定的条件。应注意各种因素对靶蛋白的影响。 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 缓冲液 可对抗蛋白质溶液中pH的改变，选择合适的缓冲液对于维持蛋白质的稳定及保证实验的重复性十分重要。 盐、金属离子和螯合剂 大多数蛋白质在稀盐溶液中才能溶解；有些金属离子是酶的组成成分，因避免与缓冲液中其他成分形成复合物；但有些靶蛋白含巯基，巯基又是活性必需的，可在缓冲液中加入金属离子螯合剂，除去有害的金属离子。 3. 还原剂 防止蛋白质被氧化失活。 4. 去垢剂 使靶蛋白更好地溶解且保持活性。 影响蛋白质提取的因素 Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics 蛋白质的分离纯化方法 蛋白质的分离纯化是依据其溶解性、分子质量大小及形状、电离性质和生物学功能的差异而进行的。分离纯化的方法可分类如下： ①以溶解度的差异为依据的方法：盐析、分配层析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀和结晶等； ②以分子大小及形状差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤层析等； Zhejiang Provincial Key Lab of Medic