高效液相色谱法辨析.pptVIP

（一）紫外检测器（UVD或UV） HPLC分析中因此该类检测器应用很广。 原理 样品组分通过流通池时对特定波长紫外线的吸收与浓度成正比。 检测系统 由光源、流通池、检测元件、微机及记录器等组成。 常用纯溶剂的截止波长：水190、乙腈190、甲醇205、正己烷210、乙醚220、四氢呋喃225、二氯甲烷245、氯仿245nm。 在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长（截止波长）。 特点 ①灵敏度高,噪音低，最小检出量可达10-12g ②不破坏样品，能与其它检测器串联。 ③对温度及流速波动不敏感，可用于梯度淋洗。 ④属浓度型检测器。 弱点 ①只能检测有紫外吸收的样品； ②流动相的选择有一定限制。 紫外吸收检测器的类型 分为：固定波长型、可变波长型及二极管阵列检测器三种。 1.固定波长检测器 是光源波长固定的光度计，一般波长为254nm，相当于定波长紫外光度计。因波长不能调节，不能选择在最佳吸收波长下检测，已基本淘汰。 2．可变波长型检测器 是一台紫外——可见分光光度计或紫外分光光度计，波长可按需要选择。是HPLC配置最多的检测器。其光学结构与一般紫外分光光度计一致，主要区别是用流通池替代了比色池。通常其光程为2～10mm, 体积约为1～10 ?L。 3.光电二极管阵列检测器（PDAD） 是80年代出现的新型紫外检测器。人们想测定通过流通池时各组分的光谱获得定性信息。但因组分停留时间太短(＜1秒)，普通紫外分光光度计的扫描速度跟不上，若停留扫描则破坏了分离状态。而二极管阵列检测器用二极管阵列代替光电管，一般一个二极管对应接受光谱上一个纳米（nm）谱带宽度的单色光。可在全波长范围进行快速扫描，获得三维光谱一色谱图，同时得到定性、定量信息。 （二）荧光检测器（FD） 早期的荧光检测器是具有滤光片的荧光光度计，已基本淘汰。 目前使用的荧光检测器多是具有流通池的荧光分光光度计（直角光路）。 检测限可达1× 10-10g／ml，比紫外检测器灵敏，但只适用于能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质。 主要用于氨基酸、多环芳烃、维生素、甾体化合物、酶类、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药等的检测。 高效液相色谱法（ high performance liquid chromatography；HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱的理论与高压技术，以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分离分析方法。 概述 高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。 早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1-5cm, 长50-500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，填充的固定相颗粒直径多在150-200?m范围内。即使这样，流速仍然很低(1mL/min)，分析时间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减小填充物的粒径（3~10 ?m ）！ 直到60年代，由于在高压下操作的液压设备、高效固定相以及高灵敏检测器的出现及发展，才彻底解决了分析时间及柱效的问题。即所谓的高效液相色谱技术才真正得到广泛应用。 HPLC与经典LC区别 经典LC HPLC 仅做为一种分离手段 分离和分析 柱内径1～3cm，固定相粒径100μm 且不均匀 柱内径2～6mm，固定相粒径10μm（球形，匀浆装柱） 常压输送流动相 高压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 柱效高（H↓，n↑） 无法在线检测 可以在线检测 分析周期长 分析时间大大缩短 HPLC与经典LC区别 主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段 液相色谱流程图 PUMP Detector W Data station (Recorder) or Collection Column Mobile phase 气相色谱流程图 Detector Carrier gas Flow or pressure controller Injection port or valve Column Data station (Recorder) W HPLC与GC差别 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别 1．分析对象 GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发