细胞凋亡及其检测方医法.docVIP

神经细胞培养 第一节：细胞培养的基本知识 1定义： 组织培养 　(Tissue culture ) ： 细胞培养 (cell culture)： 器官培养 ( organ culture)： 统称为体外培养 （In vitro) 2 组织或细胞培养的优点： 1）：研究对象是活细胞 2）：研究条件可以人为的控制 3）：研究的样本可以达到比较均一性 4）：研究的内容便于观察、检测和记录 5）：研究的范围比较广泛 6）：研究的费用相对比较经济 7） ：可作为一些遗传物质的运载细胞 8) ：干细胞的广泛应用前景 3 组织或细胞培养的不足：1）与体内条件存在差异 ；2）细胞培养存在一定的不稳定性 4 培养细胞的特性 1）培养细胞生长方式： a 贴附生长型细胞 （大多数） b 悬浮生长型细胞（少数） 2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性 5 培养细胞生长的条件 1）细胞的营养需要： a 基本营养物质 ：氨基酸 、维生素、碳水化合物及一些无机离子； b 营养因子等物质 2）细胞的生存环境： a 温度：哺乳动物和人类为35~37℃；鸟类为38.5℃ b 气相及PH 值 ：O2及CO2的值： CO2=5%；PH=7.2~7.4 c 渗透压：260~320m mol/L 3) 无污染及无毒：体外培养的细胞必须生长于无污染及无毒的环境！！ 无毒：与细胞直接接触者—培养器皿、底物、培养基，蒸馏水等； 间接接触者—配制培养基的器皿、瓶盖、瓶塞等 无污染： 微生物及交叉污染 6 常用的培养用液及培养基 培养用液：水 　　　　　　　　平衡盐溶液（ＢＳＳ）（见表） 　　　　　　　　消化液１胰蛋白酶液（０．２５） 　　　　　　　　　　　２　二乙烯四乙酸二钠（ＥＤＴＡ）　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　３胶原酶 培养基：天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解乳蛋白） 　 　　　　　合成培养基（ＭＥＭ　ＤＭＥＭ ＨＡＭ`S F12　 　　　　　ＲＰＭＩ（１６４０）　１９９　Ｌ－１５等） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 常用的平衡盐溶液（g/L） Ringer (1985) PBS Eargle (1948) Hanks (1949 Dulbecco (1954) D-Hanks NaCl KCl 9．00 0．42 8．00 0．20 6．80 0．40 8．00 0．40 8．00 0．20 8．00 0．40 CaCl2 MgCl .6H2O MgSO4.7H2O 25 20 0．20 14 0．20 10 0．10 Na2HPO4.H2O 1．56 0．06 0．06 Na2HPO4.2H2O KH2PO4 0．20 1．14 0．06 42 0．20 0．06 NaHCO3 葡萄糖 酚红 20 00 0．02 35 00 0．02 0．02 35 0．02 第 二节：神经细胞体外培养的 基本概念和方案 神经细胞培养的类型 1 神经细胞的原代培养 原代培养（primary culture)：指从活体获得细胞、组织或器官在体外条件下进行的第一次培养 传代培养(subculture)：当细胞持续生长到达一定密度之后，就应当将细胞分成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的培养液为传代培养。 2神经细胞系培养 细胞系的生长过程： 有限细胞系：原代培养　 传代期　 衰退期 无限细胞系：　滞留期 指数增长期 平台期 二、常用试剂 1） 培养液 A DMEM ： B F12 培养液 C DMEM/F12 培养液 D 无血清培养液加神经营养因子 2） D-Hank`液（其中可加入牛血清白蛋白3g/L）（HBSS） 聚L -赖氨酸：处理培养皿（瓶）（10mg/L）5-10 min 神经营养因子： 睫状神经营养因子（ ciliary neurotrophic factor, CNTF): 支持交感