植物细胞培养与次生产物生产4.ppt

第一节 悬浮培养(suspension culture) 悬浮培养：细胞培养的基本方法，是将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。 液体状态下便于细胞和营养物质的充分接触和交换，细胞状态可以相对保持一致，因此有利于在细胞水平上进行各种遗传操作、生理生化活动的研究，同时为植物细胞的大规模培养提供了技术基础。 悬浮培养必须获得大量细胞。早期多采用叶肉细胞和根尖细胞作为细胞来源。现在多采用愈伤组织作为起始细胞来源。 悬浮培养与固体培养比较有三个优点： 一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应； 二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害； 三是振荡培养可以适当改善气体的交换。 一. 愈伤组织诱导 愈伤组织的要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎。 ?选择适宜的外植体：幼胚、胚轴、子叶是最常使用的外植体。优点：细胞生活能力强，增殖速度快，组织分化与器官再生能力强； 选择适宜的培养基：较高浓度激素和水解酪蛋白、脯氨酸、谷氨酰胺等；必要的附加物质对建立松散性好的愈伤组织有利。 愈伤组织的培养阶段必须进行必要的选择和继代，以获得均匀一致的疏松性。 悬浮系的建立与继代培养： 开始进行悬浮培养时，先取一定量的愈伤组织放入盛有液体培养基（30或70ml）的三角瓶(150或250ml)中，按每克鲜重10ml培养基的比例接种； 接种三角瓶置于120r/min的摇床上，25℃条件下黑暗培养，在培养初期，悬浮细胞培养物可能呈现黏稠状。一般每隔3天更换一次新鲜培养基； 为了保持悬浮细胞一直处于一个相对稳定的良好状态下，一般每隔1-2周继代一次。每次继代时筛选细胞生活力好的细胞继代，淘汰过大和生理状态不好的细胞和细胞团； 悬浮系的建立与继代培养： 筛选方法一般采用蔗糖梯度离心法或过滤法； 继代培养时，如果继代时间是1周（2周），一般按原悬浮液与新鲜培养基1：4（1：8）比例混合； 悬浮细胞系稳定后，继代培养的振荡频率可适当降低， 一般为80r/min。 一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件： 悬浮培养物分散性良好，细胞团较小，一般在30～50个细胞以下，在实际培养中很少有完全由单细胞组成的植物细胞悬浮系。 ? 均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同。悬浮系外观为大小均一的小颗粒，培养基清澈透亮，细胞色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色。 细胞生长迅速，悬浮细胞的生 长量一般2～3天甚至更短时间 便可增加一倍。 根据不同培养时间的细胞数变化，或细胞重量变化，即可构成该培养体系的基本参数。 根据培养目的不同，悬浮细胞的起始密度一般在每毫升（0.5-2.5）*105个细胞间调整。 生长速率（p）一般通过不同时间细胞密度（x）的自然对数与起始密度（x0）的自然对数之差与培养时间（t）的比来衡量。 p = （lnx – lnx0）/ t 单位体积的细胞重量测定细胞生长情况。细胞重量采用鲜重和干重来衡量。一般鲜重只能反应细胞的生长情况，而干重则在一定程度上反应了细胞质量。鲜重和干重的测定方法比较简单，只需按一定体积取样，经真空过滤后称重即可得到鲜重，然后在80℃条件下烘干细胞至恒重即可获得细胞干重。 影响悬浮细胞生长的因素： ?起始愈伤组织的质量； ?接种细胞密度：接种初期的细胞密度过低往往使延迟期加长，悬浮细胞的起始密度一般在0.5～2.5×105个细胞/毫升，低于这一密度则会使细胞生长延迟； ?培养条件：方式、温度、继代周期。 四、悬浮培养细胞的同步化 P56 细胞同步化：指同一悬浮培养体系的所有细胞都同时通过细胞周期的某一特定时期。 植物细胞在悬浮培养中的游离性较差，容易团聚并进入不同程度的分化状态，因此，要达到完全同步化对于植物细胞培养来讲是十分困难的。 也正是因为同一培养体系的植物细胞通常并不能处于同一细胞周期，这种差异使悬浮细胞的分裂、代谢以及生理生化状态等更趋复杂化。 通过一定的理化措施可以使同一体系中的细胞达到相对同步化或部分同步化。 饥饿法：饥饿也是调整细胞同步化的方法之一。在一个培养体系中，如果细胞生长的基本成分丧失，则导致细胞因饥饿而分裂受阻，从而停留在某一分裂时期，当在培养基中加入所缺乏的成分或者将饥饿细胞转入完整培养基中继代培养时，则细胞分裂又可重新恢复。 饥饿导致的细胞分裂受阻常常是使细胞不能合成DNA，即不能进入S期，或细胞分裂不能进行，即不能进入M期。因此，通过饥饿法可以获得处于G1和G2期的同步化细胞。 研究显示，当细胞处于氮饥饿时，通常获得G1期的同步化细胞，当细胞处于磷和碳饥饿时，则获得G1和G2期的同步化细胞（Chawla，1999）。 抑制剂法：通过一些DNA合成抑制剂处理细胞，