第六章以大肠杆菌为宿主的克隆载体.ppt

6.1 以大肠杆菌质粒为基础的质粒克隆载体 DNA克隆中使用最多的、最简单的克隆载体是由小的细菌质粒演化来的。 利用E.coli作为宿主的质粒载体种类很多。 它们具有许多有用的特性：容易提取、转化效率高、携带筛选标记（转化体和重组体） ，还可用它来克隆很大的DNA-片段（达8kb）。这样的载体在大多数常规克隆实验中都会使用。 pBR322是最早被构建至今仍被广泛使用的载体。 6.1.1 质粒克隆载体的命名 pBR322这个名字符合载体命名法的标准规则。 —“p” plasmid的首字母，说明是一个质粒。 —“BR”指组建这个质粒的实验室（ BR代表了两个构建人的名字：Bolivar和Rodriguez）。 —“322”是将该质粒与同一个实验室中发展的其它质粒区分开的编号（比如还有pBR325，pBR327，pBR328等）。 质粒载体的基因和物理图分析（以pBR322为例） 6.1.2 pBR322的优点： 1、具有较小的相对分子质量：只有4363bp（一个克隆载体的大小应该小于10kb）。 2、两个抗生素抗性选择标记基因（ampR和TetR），而且每个抗性基因内都有限制性单酶切位点，可导致抗性基因插入失活。 3、相当高的拷贝数：通常在被转化的E.coli中有大约15个pBR322质粒分子，而且在氯霉素存在下，经过扩增每个细胞中拷贝数可达1000-3000个。 6.1.3 pBR322的家谱： pBR322由3个在自然界存在的天然质粒拼接而成。 R1（ampR）：抗生素耐药性质粒R1， R6-5（TetR）：抗生素耐药性质粒R6-5， pMB1（复制起点）：ColE1菌株中生产大肠杆菌素的质粒。 pBR322的详细建造过程见图6-2a。 6.1.4 其他典型的大肠杆菌质粒克隆载体 大肠杆菌质粒克隆载体很多，并且，许多大肠杆菌质粒克隆载体都与pBR322的特性和用途非常相似。我们重点介绍由pBR322改造来的四个载体：pBR325 、pAT153和pBR327、pUC8 。这些载体中，每个载体都有一个附加的特征，使它们在一定的克隆实验中比原来的质粒具有更明显的优点。 pBR325 具有三个可选择的标记 pBR325很明显地是一个具有附加DNA-片段的pBR322质粒，这个片段含有一个氯霉素-乙酰转移酶（CAT），它可以使氯霉素失活，使质粒具有抗氯霉素抗性。在这个质粒中CAT-基因中有唯一的一个EcoRI切点。如果用这个切点进行克隆，就可根据对氯霉素抗性的丧失来识别重组体。 与pBR322相比，pBR325有两个优点： 1）多了一个用于克隆的限制性识别位点（pBR322也有一个EcoRI切点，但它既不在ampR,也不在tetR基因里） 2）第三个用作选择标记的抗生素抗性基因。 pAT153和pBR327 pAT153和pBR327都是多拷贝质粒 这两种质粒均来自pBR322，在构建时，并非关系到新的选择标记或者附加限制性位点。组建这两个质粒时，pBR322的一大段被切去，在pAT153里切掉了705bp，而在pBR327则切掉了1089 bp。ampR和tetR则完整保留着。但质粒的复制特征和连接特征发生了变化。 pAT153、pBR327与pBR322的区别： pAT153和pBR327与pBR322有两方面的区别： pAT153和pBR327的拷贝数都多于pBR322 在总的拷贝数上前两者为30-45个分子。这个特性对质粒产量没有多大意义，因为对所有这三种质粒来说，通过扩增其拷贝数可提高到1000个。在正常细胞中的较高的拷贝数利于在实验室中研究克隆基因的功能。这种情况下，基因量（gendosis）很重要，因为拷贝数越高，实验中克隆基因对宿主细胞的影响作用越容易观察到。对此类研究，pAT153和pBR327就比pBR322更合适。 在pAT153和pBR327中pBR322的连接特性被破坏了。 pAT153和pBR327成为非接合性质粒，不能转移到其它的E.coli细胞中。这对生物的安全有意义，这一特性可避免重组的pAT153和pBR327分子从试管中泄漏，而侵入到工作马虎的分子生物学工作者的肠道菌群里去。与此相反，pBR322理论上可以通过连接转移到E.coli的自然种群里，实际上，这种质粒也具有保护功能，使这种转移过程成为不可能。因此如果某个克隆基因在发生事故时会有危险，还是最好使用pAT153和pBR327。 pUC8 pUC8可依靠LacZ`-基因通过蓝白斑辅助筛选。 pUC8来自pBR322，仅保留了其复制起点和ampR基因。并且这个抗性基因的核苷酸序列也发生了改变：原来抗性基因里的限制性内切酶位点已不存在。在pUC8里这些酶切位点都集中于LacZ`基因的序列中