RNA干扰Livin基因对甲状腺乳头状癌增殖及侵袭抑制作用及其分子机制.docVIP

RNA干扰Livin基因对甲状腺乳头状癌增殖及侵袭抑制作用及其分子机制 　　【摘要】 目的：探?Livin对甲状腺乳头状癌TPC-1细胞增殖、凋亡及侵袭的影响以及可能的调控分子机制。方法：构建靶向Livin基因的慢病毒shRNA载体，转染甲状腺乳头状癌细胞株TPC-1，实验分为干扰组、阴性对照组和空白组。应用RT-PCR和Western印迹检测转染Livin-shRNA后细胞Livin mRNA和蛋白表达水平的变化。应用MTT、流式细胞仪、Western印迹与Transwell侵袭实验检测Livin对甲状腺乳头状癌细胞增殖、凋亡及侵袭的影响。并接种于裸鼠模型中，进一步确定Livin在体内对甲状腺乳头状癌细胞的影响。结果：慢病毒Livin-shRNA载体成功抑制TPC-1细胞中Livin mRNA和蛋白的表达；转染Livin-shRNA后TPC-1细胞的增殖能力受到明显抑制（P 　　【Key words】 Thyroid neoplasm； Livin； RNA interference； Invasion； Migration； Animal model First-authors address：The Peoples Hospital of Binzhou，Binzhou 256610，China doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.14.002 甲状腺乳头状癌的发病率正逐年上升。Livin与肿瘤的发生、恶性侵袭和转移具有密切相关性[1-2]。笔者前期研究结果已发现Livin在甲状腺乳头状癌组织中呈高表达状态，并且Livin与肿瘤的临床分期、淋巴结转移都明显有关[3]。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号转导通路在肿瘤细胞的侵袭转移过程之中发挥着重要的作用，3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）及第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（PTEN）是该信号通路的重要基因[4]。新近的研究结果表明，Livin?能够明显促进肺癌及口腔鳞癌细胞的增殖、局部侵袭和转移[5-6] 本研究通过构建慢病毒载体介导的shRNA沉默甲状腺乳头状癌细胞中Livin基因，观察Livin对甲状腺乳头状癌TPC-1细胞的生物学行为的影响，构建裸鼠成瘤模型，分析Livin促进甲状腺乳头状癌细胞生长及侵袭转移的作用机理。现报道如下 1 材料与方法 1.1 材料 人甲状腺乳头状癌TPC-1细胞。慢病毒载体携带质粒pGCSIL-GFP、Livin-shRNA和构建的阴性对照（scramble）序列等。反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、Trizol试剂等。BALB/C雌性裸鼠，4～6周龄，体质量在15～21 g 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 TPC-1细胞株在DMEM细胞培养液中培养，在温度为37 ℃、5%CO2孵箱中进行培养 1.2.2 慢病毒Livin-shRNA转染，构建稳定转染Livin-shRNA的甲状腺乳头状癌TPC-1细胞选用生长较好的TPC-1细胞按照4×104个/孔的密度接种于6孔板之中，当细胞融合率能达到60%～80%的时候，选用含有沉默Livin效果最好的靶点序列（5-GGAAGAGACTTTGTCCACA-3’）及其阴性对照（scramble）序列，制备成稳定感染Livin-shRNA的TPC-1细胞干扰组及阴性对照组；无任何处理的TPC-1细胞设为空白组 1.2.3 RT-PCR实验检测Livin mRNA的表达 在细胞转染48 h后，分别收集各组的TPC-1细胞，利用Trizol RNA提取肿瘤细胞的总RNA，放置在-80 ℃冰箱暂时保存或者直接进行反转录。反转录成cDNA，在PCR扩增仪上进行扩增。将目的基因产物与内对照β-actin密度比值计算 1.2.4 Western印迹实验检测转染之后Livin蛋白表达 在细胞转染48 h后，分别收集各组TPC-1细胞，然后裂解细胞并提取总蛋白。蛋白上样、PVDF转膜，脱脂奶粉封闭，加入兔抗人Livin抗体，内参选用GAPDH，以目标蛋白电泳条带的灰度值与GAPDH灰度值之比表示相对的表达量 1.2.5 MTT实验检测细胞生长 分别收集处于对数生长期的各组细胞，然后调整细胞悬液的浓度并接种于96孔板之中，每组设定有5个复孔，加入MTT溶液和DMSO，在酶联免疫检测仪用490 nm波长测各孔吸光度（A）值，并绘制肿瘤细胞生长曲线 1.2.6 流式细胞术检测转染后TPC-1细胞周期变化 收集转染48 h后的TPC-1细胞，离心后75%乙醇固定，重悬细胞再加入PI染色剂和RNase A，流式细胞仪检测细胞周期变化 1.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡 收集转染4