第七章克隆基因的表达251.ppt

乳糖操纵元（lac operon）的结构 启动子 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。 如：pIN III系列： 2. 分泌型表达载体 pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3, （1）组成结构 Ipp lac P lac O S-D/ATG ompa 插入位点 Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。 ②调节基因：lac I ③S-D序列和起始密码ATG。 ④分泌信号肽： 大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。 ⑤插入位点区（多克隆位点）。 ① 强启动子： pIN III-comA1 表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。 ①启动子：tac ②操纵基因：lacP ③调节基因：lacI ④S-D序列 3. 融合蛋白表达载体系统----pGEX系列 （1）优点 （2）组成结构 便于融合蛋白的分离和纯化。 22 lacI tac lac O S-D/ATG GST 插入位点 TGA lacP ⑤ori：pBR322 ori ⑥融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶） GST融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱分离纯化。 （3）产物提纯 （4）产物分离 用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。 柱（column） GST 外源蛋白 凝血酶 外源蛋白 柱（column） GST GST 洗脱 柱（column） 可再利用 （5）其他融合蛋白系统 His-tag（组氨酸标签）： 在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。 His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。 人胰岛素在大肠杆菌中的表达 溴化氰 Cyanogen bromide： 一、原核生物基因表达的特点 二、原核表达系统的注意事项 三、原核生物基因表达的调控 四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位 六、影响外源基因表达效率的因素 五、几种类型的原核表达载体 七、提高表达水平常用的方法 九、外源蛋白质表达后的正确修饰 十、原核细胞表达的缺陷 八、细菌表达载体举例 原核基因表达 5’-TTGACA-3’ 5’-TATAAT-3’ ① -35box ② -10box（Pribnow Box） 六、影响外源基因表达效率的因素 1. 启动子的结构对表达效率的影响 RNA聚合酶 σ亚基的识别位点 （1）一致顺序 （2）-35区与-10区之间的距离 间隔为17bp时，启动子最强。 （3） -35区和-10区的碱基顺序 越接近一致顺序，启动子越强。 5’-TTGACA TATAAT 一致顺序 lac trp ?PL recA tac I tac II 5’-TTTACA TATGTT 5’-TTGACA TTAACT 5’-TTGACA GATACT 5’-TTGATA TATAAT 5’-TTGACA TATAAT 5’-TTGACA TTTAAT -35box -10box 5’-AGGAGGU-3’ S-D序列后面的4个碱基： 如果是A（T）, 翻译效率最高； 如果是G（C）,效率只有50%或25%。 2. 转译起始序列对表达效率的影响 （1）S-D序列 ？？？？ SD 序列与16SrＲＮＡ分子之间的碱基互补程度，可明显地影响mRNA的转译速率．当序列为５‘－ＧＧＡＧＧ－３’，可与16SrＲＮＡ３‘端完全互补，转译效率最高；而当该序列发生单碱基突变时，转译效率便会下降３０倍． AUG左侧的三个碱基也有影响。 （2）起始密码AUG ?-半乳糖苷酶的mRNA中： AUG左侧如果是UAU或CUU时，最为有效； 如果是UUC、UCA或AGG时下降20倍。 AUG右侧的三个碱基也有影响。 多顺反子的mRNA与核糖体的结合位点有一个或几个终止密码。 噬菌体外壳蛋白或核糖体蛋白mRNA的核糖体结合位点有多个U。 （3） 其它 终止子能有效控制目的基因mRNA的长度、提高mRNA的稳定性 3. 启动子与外源基因之间的距离 转录终止区的存在保证载体不会转录非必须基因，不必浪费源量和能量、不会干扰正常的表达。 增加载体的拷贝数会增加转录出的mRNA数目。增加表达效率。 4. 转录终止区对表达效率的影响 5.载体拷贝数及稳定性对表达效率的影响 6.外源蛋白在菌体中的稳定性对表达效率的影响 但过度的外源基因的表达会影响宿主的正常生长。 一、原核生物基因表达的特点 二、原核表达系统的注意事项 三、原核生物基因表达的调控 四、外源蛋白在大肠杆菌中的表达部位 六、影响外源基因表达效率的因素 五、几种类型的原核表达载体 七、提高表达水平常用的方法 九、外