噬菌体分离与纯化实验设计.docxVIP

噬菌体的分离与纯化（小组成员：宋淑芳、项媛媛、谢坤、陈金杰、陶思凡）一、实验目的学习分离纯化噬菌体的基本原理和方法，观察噬菌斑二、实验原理噬菌体感染宿主细胞后，其DNA（或RNA）在细胞体内进行复制、转录，相关基因表达，装配成完整的噬菌体颗粒，最后裂解宿主细胞或通过挤出方式从宿主细胞（宿主细胞不被杀死，如M1噬菌体）中释放出来。因此，①在液体培养基中可使浑浊的菌悬液变为清亮或较清亮。利用噬菌体的这种特性，在样品中加入敏感菌株与液体培养基混合后培养，噬菌体便能大量增殖，释放，从而可分离到特定的噬菌体。②在有宿主细菌生长的软琼脂平板上，噬菌体可裂解细菌或限制被染细菌的生长，形成透明的或浑浊的空斑，亦称噬菌斑。一个噬菌体产生一个噬菌斑，利用这种现象可将分离获得的噬菌体进行纯化。三、实验用具及材料1.菌种：大肠杆菌2.试剂：氯仿3.培养基：液体牛肉膏培养基：胰蛋白胨2g，牛肉膏0.6 g，NaCl1g，加H2O至200mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；3×牛肉膏培养液：胰蛋白陈3g，牛肉膏 0.9g，NaCl1.5g，加H2O至100mL，pH7.4，121 ℃20min高压灭菌；固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入1.5g琼脂粉，121 ℃20min高压灭菌；半固体牛肉膏培养基：每100mL液体牛肉膏培养基加入0.7g琼脂粉，121℃20min高压灭菌4.仪器及其他用品：无菌小试管、无菌吸管、玻璃涂棒、无菌细菌过滤器（孔径0.22um），恒温水浴锅等 5.阴沟污水四、实验步骤1.噬菌体的分离 ⑴制备菌悬液：用接种环在斜面上挑取少许大肠杆菌菌苔接入盛有5mL牛肉膏蛋白胨培养液的试管中，混合均匀后置37℃培养过夜 ⑵增殖培养：在盛有10mL3倍牛肉膏蛋白胨液体培养基大的三角烧瓶中加入阴沟污水20mL和大肠杆菌过夜培养物0.3mL，混合后置37℃振荡培养12～24h ⑶制备裂解液：将上述混合培养物倒入一支50mL无菌离心管中，经4000r/min离心15min；将上清液小心的转入另一无菌离心管中，所得裂解液经37℃培养过夜，以作无菌检查，此为噬菌体裂解液；还可加入几滴氯仿，稍作混合，备用 ⑷噬菌体检测:在牛肉膏蛋白胨琼脂平板上加入0.1mL大肠杆菌菌液，用无菌玻璃涂棒将菌液均匀地涂布在培养基表面上。待平板菌液干后分别滴加数小滴裂解液于其上，置37℃培养过夜。如果滴有裂解液处形成无菌生长的透明或浑浊噬菌斑，便证明裂解液中有大肠杆菌噬菌体 2.噬菌体的纯化⑴取上经证实的噬菌体裂解液0.1mL于一支无菌试管中，再加入0.1mL新鲜的大肠杆菌培养物，混合均匀； ⑵取上层琼脂培养基溶化并冷却至55℃（可预先溶化后置50～55℃水浴锅内保温备用），加入0.2mL上述噬菌体与细菌的混合物，混匀后快速倒入含地层培养进的平板上，铺匀，置37℃培养24h； ⑶取出培养的平板仔细观察平板上噬菌斑的形态特征（如噬菌斑形状、大小、清亮程度等）。此过程制备的裂解液中往往有多种噬菌体，需进一步纯化； ⑷纯化时，通常采用接种针在单个噬菌斑中刺一下，蘸取少许噬菌体接入含有大肠杆菌的液体培养基中，置37℃振荡培养，直至试管中菌悬液由浑浊变清；培养物经离心后取上清液，再重复步骤⑵、⑶直到出现的噬菌斑形态一致为止五、实验结果 仔细观察和比较平板上出现的不同噬菌斑的形态特性并绘图六、注意事项 1.使用仪器要保证是无菌的； 2.注意琼脂的浓度； 3.氯仿是易燃品，应远离火焰