心血管药理学的研究方法—培训课件.pptVIP

* apoE基因敲除小鼠1992年培育成功。 成熟apoE由299个氨基酸组成，主要由肝分泌作为各种循环脂蛋白的成分。apoE的主要功能是作为一个配体帮助富含甘油三酸酯的脂蛋白结合到几乎在所有的外周细胞中都表达的apoB／apoE受体上。 ApoE主要存在于VLDL中，占其蛋白质含量的10％~20％。CM和HDL中也含有少量。ApoE的主要功能是与脂蛋白，LDL—R和HSPG(包括肝素)相互作用，介导CM，VLDL及其残粒在循环系统中的清除。 载脂蛋白E是Shore在1973年于正常人极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)中首先发现的，其分子量为34KDa，主要分布于VLDL、乳糜微粒(chylomicron，CM)及其残骸中，它既是机体LDL受体的配体，也是肝细胞CM 及V-LDL残骸和部分HDL(含载脂蛋白E)受体的配基，在脂蛋白代谢中发挥重要的作用。已发现载脂蛋白E基因缺陷小鼠肝细胞分泌VLDL和TG 含量较野生型小鼠显著减少，载脂蛋白E与血浆胆固醇水平密切相关，CM 和V-LDL的残骸清除主要由载脂蛋白E介导，由于TG含量减少，胆固醇含量增加，当载脂蛋白E缺陷时则导致高胆固醇血症，所以说，载脂蛋白E具有抗动脉粥样硬化的作用，可能与载脂蛋白E能增加外周细胞胆固醇的流出及血浆中含胆固醇脂蛋白的清除有关。 * 　まず、骨髄由来の細胞を同定するために、大阪大学の岡部先生から分与されたGFP発現トランスジェニックマウスの骨髄をC57BL/6マウスに移植して、骨髄由来の細胞の同定を可能にしました。移植4週間後、Donor由来の骨髄細胞のRecipientへの生着を確認したあと、次のスライドでしめすように、ポリエチレンのカフを用いて血管傷害手術を行いました。 * 　これはカフによるマウス血管傷害モデル作成の模式図です。現在、マウス血管傷害動物モデルとして、ワイヤー傷害モデル、カフ傷害モデルなどが確立されています。しかし、ワイヤー傷害モデルでは、マウスの血管が細いため、高度な手技が要求されると共に，傷害の際には個体によってばらつきが生じやすい欠点があると指摘されています。そのため、私達は手技的に操作しやすいカフ傷害モデルを選びました。まず、右側の大腿動脈を周囲の組織から剥離し、ポリエチレンのカフをその外側に装着します。一方左側はシャム手術を行う対照とします? ? * そこで私たちは先にのべたカフモデルを用いてこの問題にとりくむことに致しました。これはその実験プロトコールです。カフ装着後先に述べた抗c-fms抗体AFS98、それから佐野先生が以前用いられたマウスPDGF受容体βに対するラットモノクローナル抗体ABP5それぞれ１mgをマウスに毎日投与し、２週後に屠殺致しました。 * このことは、何を意味するのでしょうか？左は先に述べた粥状動脈硬化の細胞階層です。一方血管再構築病巣においては、マクロファージの分化を遮断しても平滑筋細胞類似細胞の集簇には影響なく、逆に平滑筋細胞への分化を抑えるとマクロファージ系細胞の増加が見られました。 * 　この問いに答えるため、私達は血管平滑筋細胞に対する特異的な抗体でここで示す免疫組織染色を新たに行いました。中央のパネルに示すようにα-actin陽性の平滑筋細胞が確認されました。このパネルの右下の図はカフ装着後2週間目の所見ですが、マージしたイメージ上で黄色に染色される細胞が認められます。このことから、平滑筋細胞の一部は骨髄細胞に起源を有していると考えられます? 　一方、右上パネルは、１週間目の所見ですが、そのように黄色く染まる細胞は認められませんでした。 * 　CD31は単球系細胞にも発現している可能性があるため、私達は内皮細胞特異的なvWF（フォンビルブランド　ファクター）に対する抗体を用いて、二重染色を行いました。 　中央のパネルで示すように、病変部に存在する血管内皮細胞が多数認められましたが、右下のパネルの矢印で示すように、骨髄由来の内皮細胞は極少数でした。大部分の内皮細胞はGFP陽性ではないことから、それらの内皮細胞は局所の血管から遊走し、栄養血管を形成していることが考えられます。 　一方、上のパネルは、１週間目の所見ですが、そのように黄色く染まる細胞は認められませんでした。 ◎ 行动灵敏，易发生逃逸。 ◎ 性情较其他品系小鼠急，抓持不当易被咬伤。 ◎ 成年雄鼠之间易发生撕咬。 apoE-/-小鼠 ◎ 较好地反映人类胆固醇代谢的调节。如肝脏合成胆固醇的比例，人内源性胆固醇约有90%是肝外组织合成的，雄性金黄地鼠肝外合成比例约为85%，而雌性大鼠只有35%是肝外合成、雌性小鼠只有55%在肝外合成。 ◎ 较低的高脂负荷即可建立理想的动物模