详细介绍抗体的生产制备-1.ppt

2016.12.05 抗体的生产制备 12/10/2019 2 特异性抗体的制备与纯化技术 多克隆抗体（抗血清） 单克隆抗体（杂交瘤技术） 单克隆抗体与多克隆抗体 12/10/2019 3 12/10/2019 4 抗体发展史 抗体制备技术主要经历了三代： 第一代抗体是传统的抗体制备方法即利用抗原免疫动物后获得抗体，称为多克隆抗体（polyclonal antibody）； 第二代抗体是通过杂交瘤技术制备出针对抗原中某一抗原决定簇的抗体称为单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）； 第三代抗体是利用基因工程技术制备而来，称为基因工程抗体（genetic engineering antibody）。 第一节 多克隆抗体的制备与纯化 12/10/2019 5 克隆（clone）:是指无性繁殖细胞系，是由单一个祖先细胞分裂繁殖而形成的一簇细胞纯系。在这个家族的所有成员中，如无突变发生，其基因是完全相同的。 多克隆抗体（polyclonal antibody , pAb）：用一种包含多种抗原决定簇的抗原免疫细胞，可刺激多个B细胞克隆产生针对多个抗原表位的不同抗体。多获得的免疫血清实际上是含有多种抗体的混合物，即多克隆抗体。 单克隆抗体（monoclonal antibody, mAb）:由一个识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体。高度均一、特异性强、效价高、少或无交叉反应性。 12/10/2019 6 多克隆抗体（抗血清）的制备流程 12/10/2019 7 （一）抗原的制备 （二）免疫动物 （三）免疫血清的收集、分离和保存 （四）抗体的纯化 （五）免疫血清的鉴定 （六）免疫失败的可能原因及应采取的措施 12/10/2019 8 （一）抗原的制备 免疫原（immunogen）指能刺激机体免疫系统产生特异性抗体或致敏淋巴细胞；抗原最重要的性质是免疫原性（immunogenicity） 免疫原—天然抗原、人工合成抗原； 蛋白质、多糖、脂类、核酸抗原； 免疫原的分类： （一）细胞性抗原制备： 绵羊红细胞（SRBC）- 溶血素； 细菌- 抗菌抗体（动物免疫血清） （二）可溶性抗原制备： 指蛋白质、多糖和脂类等。 12/10/2019 9 细胞性抗原：主要包括人、动物的细胞，还有细菌、螺旋体及寄生虫等。 如菌体（O）抗原的制备：选择标准菌株，接种于斜面或平板培养基表面；置温箱37℃ 培养24h，用适量的无菌生理盐水刮下菌苔，移入无菌含有玻璃珠的三角瓶中，充分摇匀菌体；100 ℃ 水浴2～2.5h杀菌并破坏鞭毛抗原。取处理过的菌液，检测有无活菌的存在，合格后用无菌生理盐水稀释成每毫升8亿～10亿个细菌，加入苯酚（石炭酸）至最终浓度为5％，即为O抗原。 1）细胞性抗原或颗粒性抗原 2）可溶性抗原 12/10/2019 10 可溶性抗原主要包括蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、脂多糖、酶、补体、细菌外毒素、核酸等。它们大多数来源组织细胞，成分复杂。制备这类抗原时，首先需将组织和细胞破碎，然后再从组织和细胞匀浆中提取目的成分，提纯后的抗原需鉴定后才能用做免疫原。 （1）组织匀浆的制备：所有的组织必须是新鲜的或低温保存的。器官或组织获得后立即去除表面的包膜或结缔组织以及大血管，在4 ℃水浴或冰浴中将洗净的组织剪成小块，加入适量生理盐水，装入捣碎机破碎制成组织匀浆。 （2）细胞破碎：提取细胞可溶性抗原，需将细胞破碎，常用方法有冷热交替法、超声破碎法，反复冻融法、自溶法和酶处理法等。 （3）蛋白提纯 12/10/2019 11 ① 超速离心法：常用密度梯度介质有蔗糖、甘油； ② 选择性沉淀法（盐析沉淀法）：其原理是根据蛋白质理化特性的差异，采用各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原成分沉淀，从而达到纯化的目的。如选用33～50％饱和度的硫酸胺收集沉淀物； 12/10/2019 12 ③ 凝胶层析法（分子筛层析）：蛋白质分子按大小被分离； ④ 离子交换层析；带电的生物大分子和离子交换色谱填料上的离子基团进行交换而被分离纯化。以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离； ⑤ 亲和层析：利用生物大分子的生物特异性如抗原抗体、激素受体、IgG和葡糖球菌蛋白A（SPA）； ⑥ 制备电泳技术。 12/10/2019 13 ⑦ 其