淋巴细胞转化实验11.12.13.pptVIP

细胞培养技术 2011.12.13 细胞培养概述 细胞培养（cell culture）：从体内取出组织或细胞，在体外模拟体内的生理环境，在无菌、适宜温度和一定营养条件下使其生长，并维持其结构和功能的方法。 细胞培养技术是生命科学中常用的研究手段，亦是生命科学各研究领域的基础技术和基本技能。 细胞培养实验的基本要求 实验前准备：超净台紫外线消毒30min；无菌室每周消毒1-2次；所用器材要经过严格消毒；操作前用消毒液浸泡手或用75%酒精擦拭。 细胞培养条件 合成培养基：根据体内细胞生存所需的物质种类和数量，用化学物质模拟合成。 常用的培养基有RPMI-1640、DMEM、IMDM等。 血清：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清。 抗菌素：抑制可能存在的细菌和霉菌的生长，而不影响细胞的生长。 　常用青、链霉素；庆大霉素等。 消化液（培养贴壁细胞用）：0.25%胰蛋白酶、EDTA液 pH调整液 NaHCO3溶液：常用浓度为5.6%和7.4% Hepes液：可较长时间保持较强的缓冲作用 培养条件：无菌、３７℃、５％ＣＯ２ 细胞培养基本技术 细胞原代培养：从供体获取组织细胞的首次培养。原代细胞离体时间短，在一定程度上能反映体内的生长特性。适合作药物测试、细胞分化和转化等实验研究。 细胞传代培养：原代培养细胞长到一定密度时，需进行传代培养。 √悬浮生长细胞传代：离心法 √半悬浮生长细胞传代：直接吹打法 √贴壁生长细胞传代：胰酶消化法 细胞的冻存、复苏与运输 细胞的冻存 10％DMSO（低温保护剂），20％以上的血清，其余为培养基，细胞数1×106个-1×107个。二步冻结法。 细胞培养常见污染及处理方法 原理 淋巴细胞在体外培养时，受到刺激剂的刺激后可表现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增殖。此现象称为淋巴细胞转化现象（简称为淋转）。 淋巴细胞转化率的高低可以反映机体的免疫水平，因此可作为测定机体免疫功能的指标之一。 T细胞、B细胞表面具有抗原识别受体和有丝分裂原受体 ★植物血凝素（PHA）、刀豆蛋白A（ConA）可选择性刺激T细胞增殖； ★脂多糖（LPS）可刺激B细胞增殖； 作用于人和小鼠T/B淋巴细胞的重要丝裂原 实验流程 分离人外周血单个核细胞（PBMC） 分离人淋巴细胞(磁珠分离，流式细胞术) 淋巴细胞转化试验 基本原理：由于血液标本中各种细胞比重不同，红细胞、中性粒细胞比重为1.092，单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）比重为1.075－1.090；Ficoll比重为1.077±0.001。将血液标本置于分层上，经离心沉淀，比重高的红细胞、多核白细胞沉于管底，而比重小的淋巴细胞和单核细胞悬浮于血浆和分层液的界面层中。 基本原理： 在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖； 有丝分裂原可作为多克隆刺激剂，使相应淋巴细胞发生增殖。 形态计数法、MTT法、CCK-8法、同位素法。 （一）形态计数法：计数淋巴母细胞的比例，计算转化百分率。 （二）MTT法：MTT是一种噻唑盐。活细胞内线粒体琥珀酸脱氢酶以MTT为底物，形成蓝色的甲臜（Formazan）颗粒沉积于细胞内或细胞周围，经ＤＭＳＯ溶解后为紫色溶液，可用酶标测定仪测定OD570的值。 取静脉血3ml,用PBS（吸管1）稀释1倍（滴管1） （共6ml） 将稀释好的静脉血沿管壁缓慢加入到淋巴细胞分离液（3ml）的上方（滴管1）,2000rpm,20min 将滴管（滴管2）插入到白膜层，吸取单个核细胞层，转移至另一离心管中，加入PBS （吸管1）至5ml,1500rpm,10min.弃上清，再洗涤细胞1次（吸管1） （滴管2）.离心之前计数细胞 弃上清,加入完全培养基（吸管2）,重悬细胞（滴管2）.将细胞浓度调整为2*106个/ml. 将细胞加入96孔板（加样枪）,100ul/孔 A组：加入不同浓度的ConA,100ul/孔.每个浓度为2复孔.留2个孔仅加入培养基，作为空白对照. B组：加入100ul ConA(10ug/ml),则终浓度为5ug/ml.4复孔.设空白对照. A组：置培养箱中培养66h,加入MTT溶液20ul/孔,继续培养6hr后,去掉上清,加入DMSO100ul/孔,弃分混匀,测OD570nm值. B组：置培养箱中培养66h，制备流式标本，上机检测 注意无菌操作 操作中尽可能短时间内完成，以减少死细胞数 将稀释血加于分离液时，动作要轻柔 离心时，加速度与减速度要均匀平稳，不能用离心机“刹车”档 分离不同种属动物的PBMC要用不同的淋巴细胞分离液 细胞数量、刺激剂浓度需要在预实验中摸索最适条件 * LOGO LOGO 实验中要求： ?一切操作