RNA干扰Livin基因表达对膀胱癌细胞增殖及凋亡能力影响.pdfVIP

RNA干扰Livin基因表达对膀胱癌细胞 增殖与凋亡能力的影响 博士研究生： 杨德勇 指导教师： 宋希双 教授 专业名称： 泌尿外科学 摘 要 of Proteins， Livin是最近发现的凋亡抑制蛋白(Inhibitor Apoptosis 细胞内源性和外源性凋亡的发生。已有研究表明，Livin在多种恶性肿瘤 组织中(如黑色素瘤，肺癌，直肠癌等)呈现高表达，而在其相应的正常 组织中不表达。其阳性表达往往与肿瘤的预后以及对化疗药物的抵抗密 切相关。然而在膀胱癌中，Livin的表达情况以及Livin基因与膀胱癌预 后以及对化疗敏感性的关系目前研究尚少。我们前期研究结果表明， Livin在膀胱癌标本中的阳性表达率高达78％，并与膀胱癌的分期有密切 关系。Livin如何调控膀胱癌细胞的增殖、凋亡以及对化疗的敏感性有待 于深入研究。 目的：(1)检测Livin基因在膀胱癌细胞系中的表达情况，并使用RNAi 的方法高效特异抑制Livin在膀胱癌细胞中的表达，观察Livin基因对膀 胱癌增殖、凋亡以及对化疗敏感性的影响。(2)进一步探讨Livin基因与 另两种凋亡抑制蛋白XIAP和Survivin在调节膀胱癌增殖与凋亡过程中 是否存在协同作用。(3)初步探讨超声辐照超声微泡转染siRNA的有效参 数和转染效率，为以Livin基因为靶点治疗膀胱癌寻找有效的治疗策略。 学和Western 胞系中的表达情况。通过生物信息学的方法筛选能够高效特异抑制Livin 表达的siRNA，并通过Westernblot实验观察其下调Livin在人膀胱癌 T24细胞中表达的效率。(2)通过胎盘蓝计数以及克隆形成实验检测下调 T24细胞中的表达，使用MTT实验和克隆形成实验比较联合干扰与单独 比较联合抑制与单独抑制lAPs对膀胱癌细胞凋亡能力的影响。(4)使用 超声微泡的方法向T24细胞中转染荧光标记的siRNA小片段，通过荧光 显微镜和流式细胞仪观察超声微泡介导基因转染的效率，并通过MTT实 验评估超声微泡介导基因转染对细胞活力的影响。 结果： 结果显示，Livin．0【和Livin．D在膀胱癌细胞系中的这种表达差异产生在 转录水平，而不是由转录后翻译或翻译后蛋白修饰降解引起，Livin．B mRNA在膀胱癌细胞系中阴性表达。免疫细胞化学结果提示Livin主要 在膀胱癌细胞浆内表达。Westernblot结果进一步证实，在蛋白水平仅有 Livin．a阳性表达，Livin．p阴性表达。通过生物信息学的方法筛选出五种 Livin特异性siRNA，使用Western 胞中的干扰效率，结果表明5种siRNA均能够有效的抑制Livin基因的 表达。 2．下调Livin基因的表达对膀胱癌T24细胞增殖与凋亡的影响 胎盘蓝计数结果表明，下调Livin基因在膀胱癌T24细胞中的表达 可以有效的抑制膀胱癌的生长。克隆形成实验表明，与siRNA．NC相比， 下调Livin的表达仅能轻度增加T24细胞的自发性凋亡，但能够显著提 高I24细胞对肿瘤坏死因子TNF．u和化疗药物丝裂霉素的凋亡敏感性。 Western blot结果表明下调Livin基因的表达可以显著增加细胞内激活型 调节细胞的凋亡。 Western 呈现明显的高表达，而在人膀胱上皮SV．HUC．1细胞不表达或低表达。 明，与单个抑制IAP的表达相比，联合抑制IAPs的表达可以显著触发膀 2 胱癌T24细胞的自发性凋亡，增加膀胱癌细胞对化疗药物的敏感性。MTT 实验和克隆形成实验结果表明，联合抑制lAPs的表达能够更加明显的抑 制膀胱癌细胞的增殖能力和克隆形成能力。另外，联合抑制lAPs的表达 以及胞浆内Smac的表达水平。 4．超声辐照超声微泡介导siRNA转染T24细胞 实验表明，与各阴性对照组相比，超声辐照超声微泡的方法可以明 显增加siRNA向T24细胞中的转染效率。随着超声辐照强度的增加， s