RNA干扰靶向沉默PAUF基因对结肠癌细胞生物学行为影响实验的研究.pdfVIP

RNA 干扰靶向沉默 PAUF 基因对结肠癌细胞生物学行为影响的实验研究 中文摘要 RNA 干扰靶向沉默 PAUF 基因对结肠癌细胞生物学行 为影响的实验研究 中文摘要 目的： 检测胰腺腺癌上调因子（pancreatic adenocarcinoma up-regulated factor ， PAUF ）和β-连环蛋白（β-catenin ）在结肠癌患者中的表达情况，并通过RNA 干扰靶 向沉默PAUF 表达，观察其对人结肠癌细胞HCT116 增殖凋亡及侵袭能力的影响，探 讨PAUF 基因在结肠癌中的作用，为进一步研究结肠癌的基因治疗奠定基础。 方法：1.收集 48 例结肠癌标本，每份标本同时收取肿瘤组织和癌旁正常组织。 分别采用 RT-PCR ，免疫组化检测各组织中PAUF 和 β-catenin 的表达水平。培养 5 株结直肠癌细胞株，RT-PCR 检测各细胞株中PAUF 表达水平，进而筛选出高表达细 胞株 HCT116 以备后续实验用。2. 以脂质体 （lipofectamineTM2000 ）为载体将带荧光 标记的 siRNA 转染 HCT116 细胞并用流式细胞仪检测从而筛选出最佳转染条件。设 计制备针对PAUF 基因的3 组不同小干扰RNA 序列，以最佳转染条件转染细胞后分 别采用RT-PCR 以及Western 法验证干扰效果并进而筛选出最佳干扰片段以备后续实 验用。3.将先前筛选出的最佳干扰片段PAUF-siRNA2 按最佳转染条件对PAUF 高表 达细胞株HCT116 进行RNA 干扰，再分别采用四甲基偶氮唑蓝（MTT ）法，流式细 胞术（FCM ），侵袭实验，粘附实验，迁移实验检测 RNA 沉默 PAUF 后对结肠癌 HCT1 16 细胞增殖，凋亡、周期及侵袭、粘附、迁移性的影响。 结果：1.癌旁组织中PAUF 和 β-catenin 的表达量明显低于肿瘤组织(P 0.05) 。 并且，在肿瘤组织和癌旁组织中PAUF 的表达与β-catenin 的表达均呈现相关性(P 0.05) 。 PAUF 在 5 株结直肠癌细胞中均有不同程度的表达，但在HCT116 中表达量 5 最高。2.细胞数约为每孔1.5×10 个、siRNA 浓度约为80pmol，Lipofectamine2000 与 siRNA 比例为4ul:4ul(6 孔板)时，有较佳的转染效率，继续提高siRNA 浓度并不能明 显提高转染效率。将三组siRNA 转染细胞后PAUF 表达量均有不同程度下降，其中 以PAUF-siRNA2 干扰效果最明显，转染细胞后PAUF 和 β-catenin 的mRNA 和蛋白 表达明显下降。3.转染了PAUF-siRNA2 的结肠癌细胞HCT116 吸光度值降低，增殖 I 中文摘要 RNA 干扰靶向沉默 PAUF 基因对结肠癌细胞生物学行为影响的实验研究 活力下降，生长缓慢，细胞凋亡增加，且大部分停留在G2/M 期，同时，细胞的侵袭、 粘附及迁移性减低。 结论：PAUF 基因在结肠癌中高表达，沉默PAUF 基因能使PAUF 和β-catenin 的 表达明显下降，进而抑制结肠癌细胞株HCT116 增殖并加速其凋亡，其周期大部分阻 滞于G2/M 期，同时其细胞的侵袭、粘附及迁移性减低。提示PAUF-siRNA 能影响结 肠癌细胞株中WNT/β-catenin 通路的信号传导，通过靶向沉默PAUF 基因，进而下调 β-catenin 分子的表达，抑制原癌基因激活，有可能成为靶向治疗结肠癌的新策略。 关键词：结肠癌；siRNA ；PAUF ；β-catenin ；增殖；凋亡；侵袭；粘附；迁移； 作 者：刘鹏飞 指导老师：朱新国