荧光光度法测定样品中核黄素的含量 - 西北大学化学与材料科学学院.ppt

六、实验延伸 1、蛋白质是生物大分子，它能在溶液中与某些染料静电吸引或氢键结合，可用紫外可见光度法或荧光测定蛋白质。蛋白质的荧光，主要是构成它的色氨酸，络氨酸和苯丙氨酸具有的荧光，通过蛋白质的天然荧光用荧光法检测比紫外吸收法灵敏。荧光探针是一类比蛋白质荧光发射较强荧光的染料，它吸附或共价结合到蛋白质上，荧光特性会发生变化，从而可以利用荧光分析研究蛋白质的结构和测定蛋白质。 2、探讨蛋白质的激发光谱和发射光谱。 参考文献 1、杨建男 ?徐大庆 ?马勇 ?FIA荧光光度法测定粮食中的核黄素。《分析仪器》1990，V04，p11. 2、《荧光分析原理》(影印) （美）拉科维兹 编著，科学出版社 2008年03月第三版 3、《仪器分析教程》叶宪曾，张新祥 等编著，北京大学出版社2007年01月第2版 《仪器分析实验》 荧光光度法测定样品中核黄素的含量 基础化学实验Ⅳ （仪器分析实验） 化学国家级实验教学示范中心 Northwest University 日立F-4500荧光分光光度计的使用（第一次训练） 荧光激发光谱和发射光谱的制作（第一次训练） 工作曲线法（巩固训练） 实验技能训练要点 一、实验目的 二、实验原理 三、实验步骤 四、结果处理 五、思考题 六、实验延伸 一、实验目的 学习荧光分光光度法测定样品中维生素B2的分析原理。 掌握日立F-4500荧光分光光度计的使用方法，并了解此仪器的主要构造。 了解分子荧光产生的机理。 常温下，处于基态的分子吸收一定的紫外可见光的辐射能成为激发态分子，激发态分子通过无辐射跃迁至第一激发态的最低振动能级，再以辐射跃迁的形式回到基态，发出比吸收光波长长的光而产生荧光。 二、实验原理 激发光谱：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。 发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光强度与发射光波长关系曲线 荧光光谱 激发光谱 发射光谱 固定发射光波长进行激发光波长扫描，找出最大激发光波长，然后固定激发光波长进行荧光发射波长扫描，找出最大荧光发射波长。激发光波长和发射荧光波长的选择是本实验的关键。 荧光分析法 在稀溶液中，荧光强度IF与物质的浓度c有以下的关系： 当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度成线性关系： 这是荧光光谱法定量分析的理论依据。 IF----荧光强度 ?F-----荧光量子产率 b--吸收光程 ?--摩尔吸光系数 C--荧光物质浓度 a. 与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。 b. 选择性好。荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。 c. 所需试样量少、操作方法简便。 荧光分析法的特点 荧光分析仪器 常用的荧光分析仪器由激发光源、单色器、液槽、检测器和显示记录器五部分构成，如下图所示： 荧光分析仪器与分光光度计比较主要差别有两点： a.荧光分析仪器采用垂直测量方式，以消除透射光的影响； b.荧光分析仪器有两个单色器，能够获得单色性较好的激发光并消除其它杂散光干扰。 光源的要求： 发射强度足够且稳定的连续光谱 光辐射强度随波长的变化小 有足够长的使用寿命 常用气体放电灯类型： 氙灯光源 高压汞光源 氙灯 光栅：在镀铝的玻璃表面刻有数量很大的等宽度等间距条痕(600、1200、 2400条/mm )。 原理： 利用光通过光栅时 发生衍射和干涉现象而分光. 单色器 检测器 光电倍增管 样品池：四面透光，石英玻璃制 1.样品池的材料：与紫外-可见分光光度计的吸收池一样 2. 吸收池的形状：紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光 荧光分光光度计的样品池四面透光 波长范围 3. 使用注意事项 容易破碎 问题：紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？ 沾污问题 [O] 维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶，其结构式为： 维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为光黄素，光黄素的荧光比核黄素的荧光强的多，用氯仿萃取后可进行荧光测定。 但通常采用简化的方法测定维生素B2。溶液在420～450 nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，其峰值波长为525 nm。VB2的荧光在pH=6～7时最强，在pH=11时消失。故测VB2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。 核黄素(VB2) 光黄素 药片中维生素B2含量的测定 1．日立F-4500型荧光光度计及其附件。 2．容量瓶：50 mL。 3．维生素B2标准贮备液（20?g·