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酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA ） 免 疫 荧 光 技 术 课程内容 ELISA的原理 ELISA的分类 间接ELISA的具体操作 ELISA在医学中的应用实例 ELISA的原理 1.抗原抗体反应的特异性 2.抗原或抗体的固相化 3.抗原或抗体的酶标记 间接ELISA 实验目的：小鼠IgG免疫兔，检测兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价 实验材料：包被抗原：小鼠血清 待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG 酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG 聚苯乙烯酶标板 水浴箱 移液器 枪头 包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液 封闭液/ 封：5%脱脂奶粉(ALB) 稀释液/稀： pH7.4 0.05M的PBS （磷酸盐缓冲液） 洗液：PBST（PBS+0.05%吐温20） 显色液：四甲替联苯胺(TMB) 终止液/终：2M硫酸 操作步骤 倍比稀释法与加样 （一）直接法 酶催化底物液显色 TMB+ H2O2 联苯醌 + 2H2O 结果的判定 肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜色越深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。而样品显色明显且逐渐变浅，根据颜色的深浅，以“＋”、“－”表示。 测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长（TMB底物为450nm），以空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔OD值2倍为阳性。 注意事项 对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照） 倍比稀释时，要正确操作 终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准 2M H2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢 Company Logo * 　抗原-抗体反应的特点与影响因素 反应条件：自身因素: 环境因素: 适宜温度 电解质 酸碱度 特点： 特异性 可逆性 最适比例 凝集反应(agglutination):颗粒性抗原与抗体的反应。 沉淀反应(precipitation):可溶性抗原与抗体的反应。 补体参与的反应 免疫标记技术（immunolabelling technique）:用示踪物质标记抗原或抗体，进行抗原-抗体反应的检测。 抗原-抗体反应的基本检测方法 用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。 用FITC-抗IgM单抗计数B细胞 E 阳性反应的最大稀释度为待测样品的效价。 鼠IgG(抗原) 兔抗小鼠IgG(一抗) HRP-驴抗兔IgG(二抗) 免疫兔 免疫驴 包被：1：2000稀释的正常小鼠血清，4℃过夜 封闭：5%脱脂奶粉，37 ℃ ，20min 加待检抗体：倍比稀释兔抗鼠IgG抗血清，37 ℃ 15min 加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清(已稀释好) ， 37 ℃ 15min 加底物液显色 → → → → 洗涤：3次，1min/次 洗涤：3次，1min/次 洗涤：3次，1min/次 → 终止液终止显色（黄） 空白对照无显色 待测样品显色明显(蓝) E E E E 底物液 底物、终止液加50ul／孔 封 一抗 二抗 无色避光 从此步开始本次实验！ 除第一列孔外，先在其余每孔加100ul稀释液(稀)； 在第一列孔加入200ul一抗；取100ul加入第二列孔，混匀 从第二列孔取100ul液体至第三列孔； 。。。。。。 A B 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12