一种牡丹花瓣总RNA的提取方法.pdfVIP

河南农业科学 一种牡丹花瓣总RNA的提取方法 高双成，施 江，王世华，孔祥生，张苗霞 (河南科技大学农学院，河南洛阳471003) 摘要：利用CTAB改良法，以富含花青素类物质的牡丹花瓣为材料提取总RNA，经紫外光谱分析 rRNA A260／A280比值为1．9--,2．0，电泳检测到28S，18S和5S3条清晰的带，带的亮度强，且28S 是18S亮度的2倍左右，说明提取的RNA完整、未降解。 关键词：牡丹；花辩；总RNA}CTAB法 中图分类号：$685．11文献标识码：A 文章编号：1004—3268(2007)10—0093—02 牡丹(PaeoniaSU厂厂ruticosa)为芍药科(Paeo—SDS，1．0mol／L l NaCI；氯仿／异戊醇(241)，口一巯 niaceae)植物的一种，是原产我国的传统名花，已有 1500多年的栽培历史。牡丹花硕大，多姿多彩、雍水配制)，10mol／LLiCl，无水乙醇；RNA提取所用 容华贵、富丽端庄，被誉为“国色天香”、“花中之王”． 的塑料、玻璃器皿均用0．1％的DEPC浸泡24h后， 牡丹实生苗养护4-5年后方可开花，因而其常规杂高压灭菌30min。 交育种周期较长，选育一个品种往往要十几年，甚至 1．2．2检测RNA的试剂电泳缓冲液1×MOPS 数十年。因此，开展牡丹的分子生物学研究，通过基 Buffer：2mmol／LMOPS，1mmol／L EDTA(pH 8．O)，2mmol／L 因工程途径进行牡丹品种的改良，成为牡丹育种工 NaOACI1％琼脂糖凝胶；溴化乙 作者近年探索的课题。高质量的牡丹花瓣RNA提 锭(EB)，终浓度为0．5#g／mL。 取方法的建立是进行牡丹基因克隆的一个前提条 1．3 RNA的提取流程 件。目前，关于植物RNA的提取方法也很多[1叫]， (1)称取0．19新鲜或一70℃保存的花瓣于液 每一种植物及其本身的不同部位都有各自的特点， 氮中迅速研成粉末，将粉末转入2mL离心管中，加 这些特点反映在自身的结构和组成上，因此很难用 65℃预热的CTAB提取液，同时加入 入600弘L 一种方法来适应所有的植物组织[7~121。对于牡丹 10弘L口一巯基乙醇，立即剧烈涡旋振荡30s，于 来说，组织中的多糖含量高，花瓣中的多种花色素苷 65℃水浴5min，期间剧烈涡旋振荡3．-一5次。 物质更是高质量核酸提取难以去除的干扰成分。本 (2)稍微冷却后加入等体积的氯仿／异戊醇(24 研究采用改良的CTAB法成功地提取牡丹花瓣的I 1)涡旋振荡1min混匀，室温下，10000r／min离 总RNA，可直接用于RT—PCR、差异显示、North-心10min，取上清，转入另一新1．5mL离心管中。 ern杂交等试验。 (3)氯仿／异戊醇再抽提一次，转移上清至另一 离心管中。 1材料和方法 (4)加入1／4体积的10mol／LLiCI，使终浓度 1．1供试材料 为2mol／L，4℃过夜沉淀。 (5)4℃，10000 供试材料为牡丹品种洛阳红花瓣，在液氮中速