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6、聚酰胺柱层析操作 装柱：以含水溶剂系统层析，常以水装柱（反相分配色谱）；若以有机溶剂系统层析，常以极性较小的起始溶剂装柱（正相分配色谱）。 加样：100ml的聚酰胺可吸附1.5~2.5g。干法上样可参照硅胶柱层析；湿法上样多用于反相分配色谱，样品溶于或至少均匀分散在水溶液中。 洗脱：根据聚酰胺薄层层析结果确定柱层析的条件。反相分配色谱一般用水、稀至浓的乙醇；正相分配色谱一般用氯仿、氯仿-甲醇的混合溶剂。 再生：5%NaOH洗涤至溶液颜色变淡，然后蒸馏水洗至pH8~9，再以2倍量10%醋酸洗脱，最后以蒸馏水洗至中性。 黄芩二氯甲烷提取物经硅胶柱分离后的一黄酮组分 Fr.145-236 (四个黄酮类化合物) Fr.23 B Fr.33 A Fr.42-52 D Fr.55-63 C Polyamide CHCl3 CHCl3-MeOH (100:1-1:1) A B C D Fr.145-236中的四个黄酮类成分 四、葡聚糖凝胶柱层析 1、交联葡聚糖的化学结构 2、常用葡聚糖凝胶种类、分离原理 Sephadex G 系列——分子筛 葡聚糖凝胶G系列的性质 Sephadex LH20——分子筛和反相分配色谱 羟丙基交联葡聚糖凝胶，吸水量每克2ml。可在水和有机溶剂中使用，洗脱剂的选择从被分离物质的性质和溶解度两方面考虑。 3、葡聚糖凝胶柱色谱的操作 Sephadex LH20 1)、柱子的选择 细长柱(长1~1.5m，直径2~3cm) 2)、 浸泡 用上柱的洗脱溶剂浸泡3~4小时（分离小分子的G-10、15和LH20），然后搅拌排气泡。 3)、 装柱 空柱加洗脱液1/4左右，尽可能一次性加入所有凝胶，沉降、平衡至柱床不再下降为止。柱床越高，分离效果越好。 4)、加样 待液面离柱床表面1~2mm时，用滴管加入样品溶液（洗脱剂溶解），样品溶液要尽量体积小、浓度大。 5)、洗脱 洗脱剂的选择根据上柱样品的性质和样品的溶解度。分离中性物质可选择水、电解质和缓冲液；对阻滞较强的组分，可选择含水有机溶剂，或单用有机溶剂。 6)、收集和检出 带有颜色的物质可根据外观色带判断； 有强UV吸收的物质可用紫外灯照射来区分色谱带； 无或较弱紫外吸收的物质可用薄层层析行为判断。 7)、再生 用0.5N 氢氧化钠和0.5N氯化钠混合液浸泡，再用水洗至中性。 * * 植化方法学 天然药物化学教研室 邱 峰 2003年 4月 植化方法学（一） （各种色谱的分离原理及操作方法） 一、硅胶相关色谱 二、氧化铝相关色谱 三、聚酰胺柱色谱 四、葡聚糖凝胶柱色谱 五、大孔吸附柱色谱 六、离子交换柱色谱 七、反应薄层 一、硅胶相关色谱 1、硅胶的结构(SiO2.XH2O) 2、分离原理 吸附作用：氢键作用、偶极作用和静电作用等 吸附强度的大小取决于硅醇基类型、硅醇基数目（比表面积）、孔体积、平均孔径 O—Si—O—Si—OH O O O O 3、使用范围 由于硅胶的弱酸性、往往适合于分离黄酮、香豆素、蒽醌、萜、甾体等中性或弱酸性类化合物。 黄连生物碱的化学结构 薄层板： 硅胶G薄层板， 110 ?C 活化1小时 展开剂： 乙酸乙酯-氯仿-甲醇-浓氨水-二乙胺 （8:2:2:1:0.5） 检测方式：UV366nm 黄连生物碱硅胶薄层层析图谱 4、常用硅胶的规格 100~140目、100~200目（75~150?m）、200~300目（45~75 ?m ）为柱层析硅胶 10~40?m为薄层层析硅胶 2~10 ?m为高效薄层或液相色谱硅胶 5、薄层层析硅胶的种类 硅胶G:含有石膏12~14%，粒度10~40?m，pH6~7(10%)。 硅胶H:不含石膏，pH6~7(10%)。 硅胶GF254:含有石膏12~14%，pH6~7(10%)，且含有少量的荧光剂。 6、硅胶含水量与活性之间的关系 细玻璃管法测定硅胶活性 展开剂：苯 7、含水硅胶色谱 硅胶含水达17%以上为分配色谱，适宜分离生物碱、糖类、皂苷、有机酸等。表现在薄层和开放柱上，展开剂或洗脱剂为多相含水系统。 薄层板：硅胶H 展开剂： I: 正丁醇-乙酸乙酯-水 （4:1:1） II: 氯仿-甲醇-水 （65:35:10）下层 显色：10%硫酸 红参中人参皂苷的薄层色谱图 8、硅胶制备薄层 操作方法 1)、薄层的制备 20?20cm2的玻璃板一般所用硅胶量为8~20g，5‰C