影响电泳的因素1分子的形状和性质蛋白质.ppt

第二十八章 临床生化专用自动化分析 * 第四节 电泳自动化分析 电泳(electrophoresis)是溶液中带电粒子在电场中定向移动的现象。电泳技术是利用带电粒子在电场作用下定向移动的特性，对混合物组分进行分离、纯化和测定。 一、电泳的基本原理和方法 (一)电泳的基本原理 1、溶液中粒子的带电状态 溶液中粒子必须带有净电荷才能在电场中移动，如果净电荷为零，则不能移动。粒子在溶液中的带电状态主要由粒子表面的化学基团和溶液的pH决定。在某个特定的电场中，带电粒子在支持介质中可向与其所带电荷相反的电极方向移动。 2.电泳迁移率 在单位电场强度下，带电粒子的移动速度称为电泳迁移率(electrophoretic mobility)。当电泳介质是液体时，介质中带电粒子的移动速度与其所受的电场力成正比，与其在介质中移动所受的摩擦力成反比。当粒子带净电荷量越多，直径越小，在电场中移动速度愈快，根据粒子大小和净电荷含量不同，在电场中移动速率不同，从而可以在电场中彼此分离。 (二)影响电泳的因素 1.分子的形状和性质 蛋白质、核酸等生物大分子，在相对分子质量接近时，球状分子比纤维状分子移动速度快，表面电荷密度高的粒子比表面电荷密度低的粒子移动速度快。 2.电场强度 电场强度增大，电泳速度加快，但是同时电流强度也增大，产热增多。因此，需要选择适宜的电场强度。电泳时的电场强度应该是支持介质的电场强度，其值等于介质两端电压降(V)/介质长度(cm)。 3.电泳缓冲液 电泳缓冲液起着决定粒子荷电性质和荷电量的作用，同时起着导电的作用，电泳时对缓冲液的化学组成、pH和离子强度都有一定要求。 4.支持介质 支持介质对电泳的影响主要表现为吸附作用和电渗作用。 （1）吸附作用:各种支持介质或多或少对标本有吸附作用，吸附力的大小与支持介质的性质有关。纤维蛋白、淀粉为多聚葡萄糖，琼脂糖为多聚半乳糖，分子表面具有很多羟基(-OH). 这些基团可带电荷，对蛋白质、核酸等具有一定的吸附能力。 (2)电渗作用:电场中液相对固相的相对移动称为电渗。产生电渗作用的原因是固相支持介质表面带有电荷，例如淀粉、纤维素和琼脂等具有很多羟基，这些基团都带有负电荷，在固相支持介质表面形成负电层，吸附缓冲液中的正离子，形成贴壁正电层，在电场作用下向负极定向移 动。如果支持介质表面带有正电荷，则吸附缓冲液中的负离子，形成贴壁负电层，在电场作用下向正极定向移动，两种情形下均可形成电渗作用。 5.蒸发 蒸发对薄膜电泳的影响较大。滤纸、醋酸纤维素薄膜等支持介质液层薄、蓄液量少、电阻大，电泳时产热多，水分蒸发快。水分的蒸发导致支持介质中缓冲液浓缩，离子强度加大，标本分电流减小，电泳速度减慢。 (三)电泳分析的方法 1.区带染色 蛋白质区带染色常用氨基黑10B,溴酚蓝、考马斯亮蓝、丽春红等染料，加蛋白质变性剂配成染色液，达到染色和固定蛋白质区带的双重目的。 2.区带定性分析 主要是观察有无异常区带出现。常见的病理区带有:多发性骨髓瘤血清蛋白电泳可出现M带，肝硬化血清蛋白电泳可出现 β-γ桥。病理性异常区带具有诊断价值。 3.区带定量分析 常用光密度扫描法或洗脱比色法。 (1)光密度扫描法:经透明处理的醋酸纤维素薄膜、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳区带，可用光密度扫描仪扫描，绘制区带吸收峰，得到区带扫描图谱。通过计算各区带吸收峰面积与吸收峰总面积的比值，给出各组分占样品总量的百分比。如果测出样品总含量，即可计算出各组分含量。自动电泳仪均采用该法。 (2)洗脱比色法:电泳区带染色、洗脱背景后，将染色区带一一剪下，分别用适当的溶剂洗脱，比色测定。 二、电泳技术的分类 电泳技术的分类方法有多种，可从分离目的、电场强度、电泳媒介、电泳装置、缓冲液pH等不同角度分类。 ①按照分离目的不同，分为分析电泳和制备电泳。 ②按照电场强度的不同，分为 常压电泳和高压电泳。 ③按照电泳媒介不同，分为自由电泳和区带电泳。区带电泳还可按照支持介质不同分为淀粉凝胶电泳、滤纸电泳、醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酚胺凝胶电泳等;按照支持介质形式不同分为水平式电泳和垂直式电泳。 ④按照缓冲液pH是否均一分为连续pH电泳和不连续pH电泳。 三、电泳分析仪的基本结构 电泳分析仪有多种，主要介绍区带电泳仪。 1.手工电泳仪 加样、电泳、电泳后的染色和脱色等均需手工操作，目前已较少使用。 2.自动电泳仪 将电源、电泳槽、烘箱、染色缸等组合在一起，采用计算机对电泳过程进行控制，部分乃至全部操作由仪器自动完成。全自动电泳仪主要由:加样/电泳/烘干模块、染色/漂洗/烘干模块、键盘、荧光屏、电源装置和电脑等部分组成。 四、自动电泳分析仪的使用 一般操作步骤 1.分析