5放射自显影(影像).ppt

⑤金属环法：电镜自显影 在暗室内融化乳胶，按说明书要求稀释，降温至25℃，用不锈钢制成的金属环（直径4毫米）插入乳胶液中，轻轻垂直提取，金属环上即形成单层乳胶膜。将环套在载有超薄切片的铺有火棉胶的铜网上，单层乳胶膜即覆盖在切片表面。曝射后显影定影，干燥后即可在电镜下观察。 5、曝射 放射自显影的曝光时间与所使用的放射性核素种类有关。 125I需要感光48小时以上。 14C要数天～几周。 3H要10天以上，1—2个月。 6、显像处理： 显影：18-20℃，2-4min 定影：18-20℃，8-15min 水洗：清除残余显影、定影剂，20min以上 7、干燥、染色和封固： 干燥箱干燥 常规苏木素-伊红染色 盖玻片封固 五、放射自显影的影响因素 （一）放射自显影的分辩力 指2个相邻的放射性核素分子在标本中仍能显示为2个颗粒的最短距离。 分辩力的影响因素 1、乳胶中银颗粒的大小和密度：颗粒越小，密度约高，分辩力越高 2、乳胶厚度：越厚，分辩力越低 3、样品厚度：样品越厚，分辩力越低 4、样品与乳胶间的间隙：间隙越大，分辩力越低 5、曝射时间：时间延长，分辩力下降。 6、核素能量：能量越高、分辩力下降 7、显影时间：越长，分辩力下降 （二）放射自显影的本底 由其他原因（光线）造成的显影颗粒。 如暗室红光过量、暴露时间过长、温度过高、显影液配方不当… 光镜自显影应控制在1银颗粒/100μm2以下 防止潜影消退的方法有： 1.核乳胶的保存和曝光过程都要在低温下进行。 2.曝光过程最好在干燥、无氧、有CO2的条件进行。 3.曝光时间在三个月至半年时，最好在惰性气体或 N2气下进行，真空条件下进行曝光最好。 （5）磷屏成像： 用可重复使用的磷屏作为成像板 专门的读出装置。 计算机磷屏成像系统 优点： 可用于多种核素的宏观自显影 操作简便 不需胶片和显影定影等照相处理步骤 磷屏可以重复使用 缺点： 分辨率较低 目前还不能用于高倍光镜和电镜自显影 仪器价格比较昂贵 （二）放射自显影中常用的放射性核素 应考虑其射线的种类、能量和半衰期。 3H 、14C 、35S 、45Ca 、32P、33P、131I、125I 、99mTc等。 发射?射线的核素毒性都较大，一般不用于示踪研究。 单纯的发射 ?射线的放射性核素，难于在乳胶中形成潜影，自显影效果差。 核素 半衰期 β-粒子最大的能量（MeV） β-粒子平均能量（MeV） 3H 14C 32P 35S 45Ca 59Fe 89Sr 125I 131I 12.33年 5730年 14.28天 87.4天 165天 44.6天 50.5天 60.2天 8.04天 0.0188 0.155 1.71 0.167 0.258 0.461（51%）0.269（47%） 1.488 —— 0.607 0.005 0.05 0.695 0.055 0.10 0.12 0.57 0.0037 内 0.0227俄 0.205 放射自显影常用的放射性核素 四 放射自显影的基本技术和方法 （一）主要类型： 宏观自显影：整体水平 光镜自显影：细胞水平 电镜自显影：亚细胞水平 1、宏观自显影： 常用肉眼、放大镜或低倍显微镜观察 用灰度或黑度对比来判断示踪剂的部位和数量 优点是可以同时观察各脏器、组织中放射性示踪剂的分布，多用于小动物的整体标本，大动物的脏器或肢体，以及各种电泳谱、色谱和免疫沉淀板等的示踪研究。 小鼠头部的宏观自显影 凝胶电泳的自显影结果 核酸电泳展开板的放射自显影 2、光镜自显影： 以光学显微镜为工具进行观察，以镜下的银颗粒分布及数量来判断放射性核素示踪剂的部位和数量。 镜下的银颗粒为黑色或深棕色的小圆点 适用于冰冻组织切片、石蜡组织切片，血细胞涂片、骨髓细胞涂片等标本的示踪研究。 放射自显影检测寄生虫感染中的脾细胞 3、电镜自显影： 以电子显微镜观察，以电镜下银颗粒的分布及数量来判断。 电镜下电子轨迹为蛇样扭曲 适用于细胞超微结构上的精确定位和定量 蛇毒素与 乙酰胆碱 受体结合 （二）基本方法 1、基本步骤： ?示踪：向实验动物体内或离体标本上引入放射性核素标记物。 ?标本制备：取生物标本并制备成含放射性核素的切片、涂片 ?自显影制备：暗室中在制备的标本上敷加感光材料。 ?曝射：避光条件下核射线作用于感光乳胶。 ?照相处理：显影、定影、水洗、干燥、染色、封固。 ⑥阅读分析。 2、示踪剂引入的方法 ①体内实验：可由静脉、皮下、肌肉、腹腔注射或直接脑内注射和灌胃等途径给入放射性标记化合物。 ②体外实验：可在培养瓶中给入、或将示踪剂直接加在切片上