细胞的破碎.ppt

第三章细胞的破碎 概述 不同类型细胞生产目标产物的类型： 动物细胞多分泌到细胞外培养液 植物细胞多为胞内产物 微生物（细菌/酵母/霉菌等）胞内、胞外 　 概述 大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。 有些目标产物存在于细胞内的。 尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素存在于细胞内部。 细胞破碎（cell disruption）技术是指利用外力破坏细胞膜和细胞壁，使细胞内容物包括目的产物成分释放出来的技术。 细胞破碎技术是分离纯化细胞内合成的非分泌型生化物质（产品）的基础。 随着重组DNA技术和组织培养技术上的重大进展，以前认为很难获得的蛋白质现在可以大规模生产，但是很多产物是在细胞内表达的。 为了提高细胞的破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构。 第一节 细胞壁的组成与结构 微生物细胞和植物细胞外层均为细胞壁，细胞壁里面是细胞膜，动物细胞没有细胞壁，仅有细胞膜。 通常细胞壁较坚韧，细胞膜脆弱，易受渗透压冲击而破碎，因此细胞破碎的阻力主要来自于细胞壁。 不同种类细胞的细胞壁结构和组成不完全相同，故机械强度不同，细胞破碎的难易程度也就不同。 细胞壁的组成与结构 细菌细胞壁结构 细菌细胞壁结构 破碎细菌的主要阻力是来自于肽聚糖的网状结构，其网结构的致密程度和强度取决于聚糖链上所存在的肽键的数量和其交联的程度。网状结构越致密，破碎的难度越大。 革兰氏阴性菌的细胞壁结构与革兰氏阳性菌有很大不同。革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固。 革兰氏阴性菌典型的生物是大肠杆菌，通过这种细胞生产了很多细胞重组的产物。 酵母的细胞壁结构 霉菌的细胞壁 霉菌的细胞壁较厚，主要由多糖组成，其次还含有较少量的蛋白质和脂类。 不同的霉菌，细胞壁的组成有很大的不同，其中大多数霉菌的多糖壁是由几丁质和葡聚糖构成，少数含纤维素。 与酵母和细菌的细胞壁一样，霉菌细胞壁的强度和聚合物的网状结构有关，不仅如此，它还含有几丁质或纤维素的纤维状结构，所以强度有所提高。 红面包霉菌细胞壁具有同心圆层状结构主要存在三种聚合物 最外层(a)是α-和β-葡聚糖的混合物， 第2层(b)是糖蛋白的网状结构 第3层(c)主要是蛋白质， 最内层(d)主要是几丁质。 微生物细胞壁的形状、强度取决于细胞壁的组成以及它们之间相互关联的程度。 交联程度取决于连接细胞壁网状结构的共价键。同时，也受到微生物的遗传信息、培养条件、菌龄、外界环境等的影响。 植物细胞壁的结构 对于已生长结束的植物细胞壁可分为初生壁和次生壁两部分。 初生壁是细胞生长期形成的。初生壁一般较薄（1～3μm），富有弹性。 初生壁由多糖和蛋白质构成，多糖主要成分为纤维素、半纤维素和果胶类物质。纤维素是长链D-葡聚糖，许多这样的长链形成微纤丝。 微纤丝是构成植物细胞壁的骨架，细胞壁的机械强度主要来自于微纤丝。 植物次生细胞壁 某些植物细胞，当生长停止后，在细胞质和初生细胞壁之间形成了次生细胞壁。次生壁一般较厚(4μm以上)，常有三层组成。 在次生壁中，纤维素和半纤维素含量比初生壁增加很多，纤维素的微纤丝排列得更紧密和有规则，而且存在木质素的沉积。 次生壁的形成提高了细胞壁的坚硬性，使植物细胞具有很高的机械强度。 不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度也不同，由难到易的大致排列顺序为：植物细胞＞真菌（如酵母菌）＞革兰氏阳性细菌＞革兰氏阴性细菌＞动物细胞。 一　机械法 机械破碎法又可分为 高速珠磨破碎法（bead grinding） 高压匀浆破碎法（homogenization） 超声波破碎法（ultrasonication） 1. 珠磨法 bead mill 珠磨是最常用的方法 细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。 在工业规模的破碎中，常采用高速珠磨机 高速珠磨机工作原理 磨室内放置玻璃小珠，装在同心轴上的园盘搅拌器高速旋转，使细胞悬浮液和玻离小珠相互搅动； 细胞破碎是由剪切力层之间的碰撞和磨料滚动引起 在出口处，旋转园盘和出口平板之间的狭缝很小，可阻挡玻离小珠，使不被料液带出。 由于操作过程中会产生热量，故磨室还装有冷却夹套，以冷却细胞悬浮液和玻离小珠。但在大型设备中，采用夹套冷却带走热量是一个需要考虑的问题。 Netzsch LM-20型珠磨机 珠磨机破碎作用方程 破碎作用是相对于时间的一级反应速度过程，符合下列公式： ln[1/(1-R)]=Kt 15-2 R — 破碎率；K