第2章 高效液相色谱分析法_20160503233532.pptVIP

3 高效液相色谱法 定义： 以液体为流动相而设计的色谱分析仪器称为液相色谱仪； 采用高压输液泵、高效固定相和高灵敏度检测器等装置的液相色谱仪称为高效液相色谱仪。 组成部分： 高压输液系统 进样系统 分离系统 检测系统 3.3 主要部件 (2) 梯度洗脱装置 (3) 进样装置 (4) 高效分离柱 (5) 液相色谱检测器 b. 光电二极管阵列检测器 c. 示差折光检测器 d. 荧光检测器 1. 流动相特性 常用正相柱：固定相为极性，官能团主要有-CN, -NH2等，后者常称为氨基柱，主要用于极性物质的分离纯化，如蛋白质、氨基酸等。 常用反相柱：固定相为非极性，最常用的有ODS柱（C-18柱）填料为十八烷基硅烷，在反相色谱可完成高效液相色谱70～80%的分析任务，在生物化学分析工作中应用的最为广泛。 2. 流动相类别 3. 流动相选择 4. 选择流动相时应注意的几个问题 有机氯农药残留量分析 5. 尺寸排斥色谱size- exclusion chromatography 高效液相色谱分析的应用 1.茶多酚的检测 高效液相条件： 色谱柱：Diamonsil C18（5um，250mm*4.6mm） 流动相：等浓度洗脱 CH3OH-H2O-TFA（23：77：0.05） A：甲醇（色谱纯） B：0.05%的TFA水溶液（微孔过滤超声） 洗脱程序（先等度再梯度）：23%A（20min） 10min→ 40%A(5min) 5min→ 90%A(5min) 5min→ 23%A 检测波长：280nm 流速：1ml/min 柱温：35℃ 样品含量公式： 样品含量=（标品取样量*样品峰面积*标品纯度）/标品峰面积 2. 图形分析 问题：两个峰出峰时间相隔太远。 方法：增加流动相极性；增加流动 液相色谱-质谱联用 课堂作业 什么是梯度洗脱，梯度洗脱的特点及应用。 什么是正向柱和反向柱？在正相液相色谱的分离过程中, 极性 _ _的组分先流出色谱柱, 极性_ __的组分后流出色谱柱。 下列几种物质，应选择哪种色谱进行分析？ 乙醇，玫瑰精油，?-淀粉酶，脂肪酸，多糖 解决办法：使用梯度洗脱。 样品 色谱 接口 质谱 计算机处理系统 结果 A B C D . . . M+ N+ O+ P+ . . 质谱检测 样品 色谱分离 第*页 食品学院 食品学院 仪器分析 本实验室的高效液相色谱仪（岛津 LC-10A） 3.1 流程 液体流动相 高压输液泵 色谱柱 进样器 检测器 废液 信号输出 3.2 特点 特点：高压、高效、高速、高灵敏度 适用范围广，特别对高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析具有极大的优势。 (1)高压输液泵 主要部件之一，用于输送液体流动相。 高柱效的固定相粒度很小（10?m），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一,由高压输液泵实现。 可单泵使用，也可双泵使用，双泵可实现梯度洗脱。 信号采集/转换器 A泵 B泵 检测器 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。 可以根据设定的程序改变溶剂配比，从而改变流动相的极性。 流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示： a. 准备状态：样品装入样品环，流动相不进入样品环； b. 进样状态：流动相流进样品环，将样品带入色谱柱。 柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm，柱长5～40 cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 分离柱填充物的种类多样，分离机理各不相同，可将高效液相色谱法分为：液固吸附色谱法，液液分配色谱法，化学键合色谱法，离子交换色谱法等。（后面详细讲解） a. 紫外-可见光检测器 应用最广，有紫外-可见光吸收的有机化合物均可检测。 工作原理类似紫外-可见分光光度计，基于朗伯比尔定率： A=lg(1/T)=kc A -- 吸光度 c -- 样品浓度 用一组光电二极管同时检测透过样品的所有波 长紫外光。它具有以下优点: 可得任意波长的色谱图，极为方便; 可得任意时间的 光谱图，相当于与紫外联用，从而得到时间-波长-吸光度 的三维图谱。 紫外光进入流动池，从流动池出来的光再经分光系统、狭缝