人牙髓干细胞体外培养和诱导分化的实验研究.pdfVIP

人牙髓于细胞体外培养和诱导分化的实验研究 中，37。C中孵育1．5小时，期间不断振荡，随着消化时间地延长，液体逐渐变混 浊，最终看不到成形的牙髓组织。1200转，离心5分钟。弃上清，Hanks液清洗 两遍后，细胞悬液用100目细胞筛过滤，用完全培养基(含20％胎牛血清，0．5 u ％hepes，2mmol／L左旋谷氨酰胺，100u／ml青霉素，100 g／ml链霉素，Ph7．2) 将细胞混匀，接种于25cm2细胞瓶中，置37 9C5％C02培养箱内培养。@HE染 色观察细胞形态，免疫组化法检测细胞波形丝蛋白和碱性成纤维细胞生长因子及 平滑肌肌动蛋白的表达。③细胞培养14天后终止培养，4％甲醛固定15分钟， B一 吉姆萨染色计算细胞集落形成率。④20％o--MEM培养基中加入lOmmol／L 甘油磷酸钠、10_8mol／L地塞米松和50u g／ml维生素C诱导细胞向成牙本质细胞 分化，并检测培养液中碱性磷酸酶的表达水平。⑤20％n．MEM基础培养基中加 gt 入0．5mmol／L1一甲基～3一异丁基一黄嘌呤、0．5mol／L氢化可的松和60“mol／L 吲哚美辛诱导细胞向脂肪细胞分化。油红0染色鉴定。 结果：①I型胶原酶消化后的细胞第二天贴壁生长，细胞开始增殖，呈长梭 形集落样生长，细胞个体较小，细胞约15左右达到80％，E合，并可传代。②HE 染色见细胞体积较小，细胞核较大的特点，有较多的双核细胞，细胞浆呈细网状 相连，细胞问的界限不清。细胞表型免疫组化鉴定波形丝蛋白、I型胶原、碱性 成纤维细胞生长因子、o一平滑肌肌动蛋白阳性。③细胞增殖率较高，集落形成 率均数约为1．5—3．0个／104细胞。④细胞在条件培养基作用三周左右，形成细胞结 节，ConKossa氏银染色法显示细胞结节已经矿化形成矿化结节，培养液中碱性 磷酸酶(ALP)水平在第1次换液时较高，但随之培养液中的ALP水平很快下降； 到第6次换液时，ALP水平最高，以后逐渐下降。⑤细胞培养四周左右，细胞 胞浆增大，胞浆有透明的脂滴形成，油红O染色脂滴呈橙红色，证实已经诱导 分化为脂肪细胞。 结论：①采用I型胶原酶消化法在体外分离培养了人牙髓干细胞，分离的 细胞呈集落样生长，具有快速生长的特性。有强的增殖能力。②牙髓干细胞在 If 人牙髓十细胞体外培养和诱导分化的实验研究 含诱导因子地塞米松、B一磷酸甘油钠和维生素c的条件培养基中可以形成 矿化结节，碱性磷酸酶染色、钙化结节VonKossa染色均为阳性。③牙髓干细 胞在含1～甲基一3一异丁基～黄嘌岭、氢化可的松和吲哚美辛的成脂条件培养 基中可向脂肪细胞分化，油红O染色阳性。 关键词：牙髓干细胞，细胞培养，诱导，分化 III 人牙髓干圳胞体外培养和诱导分化的实验研究 Invitro of culture exprimentalstudy andinductionof differentiationof humandentalstemcells pulp Medicine Major：Oral Ren