甲基化修饰对人宫颈癌细胞系中FHIT基因的调控论文.docVIP

　　甲基化修饰对人宫颈癌细胞系中FHIT基因的调控论文 【摘要】 目的探讨FHIT在子宫颈癌发生中的作用及FHIT基因失活的机制。方法培养宫颈癌细胞C33A、HeLa、CasKi、SiHa 及人脐静脉血管内皮细胞ECV304，进行5azadC干预前后FHIT基因在5株细胞中的甲基化分析，并通过逆转录聚合酶链式反应和免疫荧光化学染色方法检测5azadC干预前后FHIT基因在5株细胞中的表达。结果4种宫颈癌细胞均存在FHIT基因的甲基化，正常对照细胞ECV304在5azadC干预前后均未见明显FHIT基因扩增产物。4株宫颈癌细胞在5azadC化学干预前均未见明显FHIT的荧光着色，而干预后的细胞胞浆中可见FHIT的表达强度明显增强，尤其在106M及2×106M干预浓度下的表达最强(P 0.05)；干预48 h、72 h后FHIT 的表达与干预24 h的类似。ECV304细胞在5azadC化学干预前后的胞浆均可见到FHIT的阳性表达，其表达强度之间无明显差异(P 0.05)。结论FHIT基因的甲基化在宫颈癌中是频发事件，甲基化可能是FHIT 基因沉默及宫颈癌发生的重要机制。 【关键词】 脆性组氨酸三联体基因（FHIT）；人宫颈癌细胞系；5azadC；DNA甲基化；免疫荧光 Pattern of FHIT Gene 5’ CpG Island Methylation Contribute to Human Cervical Carcinoma Cell Tumorigenesis Abstract：Objective To determine ethylation of FHIT played an important role in cervical tumorigenesis.MethodsBy incubating DNA in the presence of a methylase, ethylation of FHIT in four cervical cancer cell lines and one human umbilical vein endothelial cell line treating ethyltransferase inhibitor, 5aza2deoxycytidine(5azadC). The expression of FHIT onitored by RTPCR and immunofluorescence technique before and after 5azadC treatment.ResultsI 1640培养液，37℃，5％CO2培养，其余细胞均用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养液。 1.25azadC化学干预5azadC购自Sigma公司，干预时用培养基稀释为0M，5×１0-7M，10-6M，2×10-6M，5× 10-6M，10-5M的工作浓度。接种对数生长期的细胞2× 10-5/60mm培养皿，培养24小时后以上述工作浓度的5azadC进行化学干预。再培养24h和72h后，收集细胞。 1.3基因组DNA的提取参照姜泊2所著《分子生物学常用实验方法》提取高分子量细胞基因组DNA，在紫外分光光度计上测定DNA浓度和纯度，OD260/OD280的比值在1.8～2.0之间为合格。 1.4甲基化分析采用甲基化酶温育法,用10U甲基化敏感酶HpaⅡ将1 μg基因组DNA 37℃酶切过夜，以使其完全消化；同时用10U非甲基化敏感酶MspⅠ完全消化基因组DNA为对照。然后进行PCR扩增FHIT基因，引物序列及PCR反应条件参照文献3。若出现FHIT基因的扩增产物，则证实甲基化存在。 1.5逆转录聚合酶链式反应（RTPCR）用TRIZOL试剂一步法提取细胞总RNA，紫外分光光度仪检测纯度和浓度，取2μg总RNA用MMLV逆转录酶进行逆转录，PCR扩增FHIT基因，并同时扩增GAPDH作内参照，引物由上海博亚生物公司合成；引物序列及PCR反应条件参照文献4。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察、拍照。 1.6免疫荧光化学染色兔抗人FHIT多克隆一抗试剂购自北京中山生物技术公司。细胞培养24h，再用上述工作浓度的5azadC进行化学干预，培养24h、48h和72h后，取出细胞爬片，PBS冲洗， 冷丙酮固定，1%Triton X100室温作用20 min，血清封闭，再分别加入兔抗人FHIT多克隆抗体，4℃过夜后，分别加入羊抗兔FITCIgG，37℃温育后封片。实验同时设PBS代替一抗的阴性对照。 1.7统计学方法运用SPSS11.5统计软件包对实验数据进行统计学分析，采用t检验。