白芷扩增片段长度多态性反应体系的建立及优化论文.docVIP

　　白芷扩增片段长度多态性反应体系的建立及优化论文 陈要臻 郭丁丁 马逾英， 陈雯，王晓东，唐琳 【摘要】 目的建立白芷扩增片段长度多态性（AFLP）反应体系及筛选出扩增条带丰富的引物。方法以12 份白芷为试材,对AFLP 分析过程中包括提取DNA的方法、DNA 的提取质量和浓度、MseⅠ/ EcoRⅠ酶切反应时间等进行了研究，从64对引物中筛选适合白芷的引物。结果改良的CTAB方法提取的DNA质量比较好，建立了一种适于白芷AFLP 银染技术的优化体系：模板DNA 的用量为400 ng ,酶切体系中MseⅠ和EcoRⅠ反应时间为4 h，筛选出了7对适合白芷的引物。以引物E+AGC/M+CAA构建的白芷种质资源的AFLP 指纹图谱,扩增带多,多态性强。结论建立了适用于白芷的AFLP反应体系，并筛选出了适合白芷的引物.freelized AFLP(amplified fragment length polymorphism) analysis system of Angelica dahuruica.MethodsThe optimized AFLP analysis system different habitats after a parative study of the essential factors ethod. ResultsThe improved CTAB conventional method ethod. The results of the analysis system shoplate DNA e of digest system plification should be diluted to 10 times; 4)seven pairs of primer(E+AGC/M+CAA,E+ACT/M+CAC,E+AGC/M+CAC,E+AAC/M+CAC,E+ACC/M+CAC,E+AAC/M+CAG,E+ACC/M+CTC) 64 pairs by screening repeatedly. And E+AGC/ M+CAA could amplify more uniform and high sharp bands. ConclusionOur study shoolecular map ,.freelentals for further molecular studies of Angelica dahuruica using AFLP marker. Key ; Angelica dahuruica 扩增片段长度多态性（amplified fragment length polymorphism, AFLP）技术作为一项分子标记技术，是1992年由荷兰Keygene公司科学家Zabeau Mare和Vos pieter 发明并发展起来的一种选择扩增限制性酶切片段的方法［1］。AFLP是基于RFLP ( Restriction Fragment Length Polymorphism) 和PCR(Polymerase Chain Reaction) 相结合的DNA 分析技术。这种方法是一种选择性扩增限制性片段的方法,它结合了RFLP 和RAPD 的优点,既具有前者的可靠性，又具有后者的方便性。现已被广泛应用于生物多样性、指纹图谱构建、遗传图谱构建、基因克隆等诸多领域［2］。 白芷Angelica dahurica为伞形科植物，是一种常用中药，性温，味辛，具有散风除湿、通窍止痛、消肿排脓的功效。目前对白芷的研究主要集中在白芷的品质、化学成分、药理作用等方面，其种质资源多样性、亲缘关系等方面的研究也有一些报道［3，4］，但是运用AFLP技术对白芷基因组的研究还未见报道。因此本研究旨在建立一套适合于白芷的AFLP实验体系，并筛选出多态性强的引物，为进一步研究白芷的遗传多样性、种间亲缘关系AFLP实验奠定基础。 1 材料与仪器 1.1 材料白芷，2007-04采自四川遂宁GAP基地白芷种质资源圃。材料原产地见表1。样品经成都中医药大学生药教研室马逾英教授鉴定。取新鲜叶片，用硅胶迅速干燥后带回实验室，储于-70℃冰箱保存。 表1 供试材料及来源（略） 1.2 试剂EcoRⅠ，MseⅠ，T4 DNA ligase，rTaq酶，dNTPs购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司。Mse I／EcoR I接头、Mse I／EcoR I核心引物及Mse I／EcoR I选择性扩增引物由北京赛百盛基因技术有限公司合成。亲和硅烷、剥离硅烷等购于北京鼎国生物技术有限责任公司。甲叉双丙烯酰胺为瑞士进口分装。其他试剂均为国产分析纯。 1.3 仪器Bio-Rad(MC013208)PCR扩增