类固醇类激素GCMS分析中酮基衍生化技术研究进展论文.docVIP

　　类固醇类激素GCMS分析中酮基衍生化技术研究进展论文 方锴 潘学军 黄斌 刘晶靓 王宇 高建培 【摘要】 类固醇类激素以其独特的生理生化效应而备受关注，气相色谱质谱联用技术已经成为类固醇类激素分析检测的重要手段。由于类固醇类激素含有羟基、酮基等极性官能团，GCMS分析时检测灵敏度不高，色谱分离峰形差，需通过衍生化技术将其转化成极性较低、易挥发、热稳定性高的化合物，以改善色谱分离峰形、提高检测灵敏度，使之适用于GCMS痕量分析。目前，类固醇类激素羟基等含有活性氢原子官能团的衍生化技术发展较为成熟.freelethylsilyl，TMS)，可以达到较好的分析效果14,15。所以，酮基衍生化就成为GCMS分析此类物质的关键问题。 3 酮基衍生化 衍生化技术(Derivatization)是通过化学反应将样品中难于分析检测的目标化合物定量的转化成另一种易于分析检测的化合物。通过衍生化，可以降低待测物极性，提高挥发性，增加热稳定性，从而提高检测灵敏度和改善色谱峰形16，17。含酮基类固醇类激素具有多种化学性能，但对于类固醇类激素的酮基来说，化学性质主要取决于含有的碳氧双键(羰基)，其影响可归纳为两点：(1)增强羰基相邻的α碳原子上氢原子的酸性;(2)提供进行亲核加成的部位，使亲核试剂对羰基进行加成。总之，羰基氧容纳一个负电荷的能力是造成以上两点的根本原因18,19。类固醇类激素酮基衍生化就是利用以上两种性质，采取一定的技术手段以改变类固醇类激素的分子结构，达到衍生化的目的。 3.1 烯醇化硅烷化 (EnolisationSilylation) 烯醇化硅烷化是将类固醇类激素的酮基在一定条件下进行烯醇化反应，并在生成烯醇产物的同时将烯醇产物与硅烷化衍生化试剂反应，使烯醇产物上生成的和原有的羟基硅烷化，最终形成稳定的烯醇化硅烷化衍生产物(Enolsilylderivatives)。如式(1)6所示，将雄酮(Androsterone)衍生化为相应的烯醇化三甲基硅烷化产物(EnolTMSderivatives)。 (1) 3.1.1 反应原理 烯醇化是反应的关键步骤。烯醇化反应是基于类固醇类激素酮基的碳氧双键能够增强相邻α碳原子上氢原子的酸性，使类固醇类物质中α碳原子上的氢原子迁移，并使羰基的氧原子得到氢原子，形成羟基和碳碳双键18,19, 反应如式(2)18。烯醇化反应可在酸性或碱性条件下发生。在酸性条件下，烯醇化是通过羰基的质子化后失去α碳原子上的一个质子而生成烯醇;在碱性条件下，首先是由碱夺去α碳原子上的氢形成烯醇负离子，随后从带质子的溶剂分子上取得质子形成烯醇18。 (2) 在烯醇化反应中存在着酮基化合物与烯醇化产物的平衡17～19。在应用烯醇化反应中，经常将烯醇化与硅烷化反应结合起来，最常用的方法是在生成烯醇产物的同时将羟基等官能团进行三甲基硅烷化处理，最终形成稳定的烯醇化三甲基硅烷化衍生物，这样既可以使反应平衡向着烯醇化的方向进行，又可将原有和生成的羟基硅烷化，以达到理想的分析效果。 3.1.2 衍生化试剂 类固醇类激素酮基烯醇化硅烷化反应通常是在硅烷化衍生化试剂与催化剂存在的条件下进行的。最常用的硅烷化试剂为N甲基N三甲基硅基三氟乙酰胺(NmethylN(trimethylsilyl)trifluoroacetamide, MSTFA)，常用催化剂为三甲基碘硅烷(Trimethyliodosilane，TMIS)，碘化铵(Ammonium iodide，NH4I)等。除了硅烷化试剂与催化剂，在衍生化过程中常常还需要加入还原剂，如：二硫赤藓糖醇(Dithioerythreitol，DTE)，乙硫醇(Ethahiol)，1丙硫醇(1propahiol)和2巯基乙醇(2meraptoethanol)。还原剂的使用是为了稳定衍生化试剂，起到抗氧化，防止分解的作用。 目前，其它硅烷化试剂，如：N,.freelethylsilylacetamide BSA)也有应用。还原剂以DTE与乙硫醇为主。衍生化试剂各组分常用的比例范围为：1000∶2～20∶(2～5)(硅烷化试剂/催化剂/还原剂，V/V (an等5在检测肉类中雄激素、雌激素、孕激素及其代谢产物时，采用MSTFA/TMIS/DTE(1000∶2∶2, V/V/ers28 A. 去甲雄三烯醇酮(Trenbolone); B，C，D. 烯醇化异构体(Enolisation isomers)。除了异构现象的存在，在衍生化试剂中存在的亲核试剂也能够导致副产物的产生。MeunierSolère等23发现，以MSTFA/TMIS/DTE或MSTFA/NH4I/DTE为衍生化试剂时会有副产物产生。其原因是含有α,