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关于研究蛋白质细胞定位的几种方法 姓名：甄萍萍 导师：梁建生 真核细胞具有复杂的亚细胞结构，已发现数十种细胞器，每种细胞器都有一组特定的蛋白。真核细胞除叶绿体，线粒体能少量合成蛋白外，绝大部分蛋白是在胞浆或粗糙内质网合成，最终运送到不同地点，形成成熟蛋白并行使功能。译产物中很大一部分是以前体蛋白形式存在，往往有蛋白分子定位信号，可引导蛋白在胞内定位。蛋白质在细胞内的定位问题，是细胞生物学研究的中心问题，也是分子生物学研究的热门话题。了解某些蛋白质的定位从而分析探索其生物学功能，意义重大。目前，这方面的工作己取得很大进展。细胞器不同，相应的靶向蛋白的定位过程也不同。 研究蛋白的亚细胞定位可采取多种方法：免疫胶体金标记；免疫荧光；与gfp构建融合基因，用荧光显微镜观察;蔗糖密度梯度离心;多糖序列分析等。以下介绍免疫胶体金标记、免疫荧光、与gfp构建融合基因等常用方法。 1 免疫胶体金标记 金标法是Faulk和Taylor（1971）提出的，并首先用于免疫电镜。当用金标记的抗体与抗原反应时，在光镜水平胶金液呈现鲜艳的樱红色，不需加外进行染色。在电镜水平，金颗粒具有很高的电子密度，清晰可辨。因此，免疫电镜胶体金标记法近年来被成功地应用于生物学的各个方面，并取得了喜的进展用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。 3 GFP及其在生命科学研究中的应用 3.1 简介GFP 海洋生物发光是个非常普遍的现象。从原生生物到脊椎动物均有生物发光，如海萤，磷虾，腔肠动物等。从不同动物体内提取的荧光蛋白的结构、性质不尽相同，不同动物荧光发生机制有很大差别。多管水母体内存在两种发光蛋白绿色荧光蛋白:GFP和aequorin。当aequorin与3个Ca2+结合后，即发生氧化反应并发射蓝光，最大发射波长469nm。 GFP被紫外光或蓝光激发后发出绿色荧光。发光机制如下: GFP在水母体内的发光机制 GFP由gfp基因编码，具有238个氨基酸残基的多肽单体，分子量约27kD。GFP有两个吸收峰，最大吸收峰在395nm，在475nm还有一个吸收峰，前者由紫外光激发，后者由蓝光激发。发射光谱也有两个峰值:509nm和540nm,呈绿色或黄绿色荧光。 GFP荧光的产生主要归功于分子内第65, 66, 67位丝氨酸、酪氨酸、甘氨酸形成生色团的功效。翻译出的蛋白折叠环化后，在O2存在下分子内第67位甘氨酸的酰基对第65位丝氨酸的羧基的亲核攻击形成第5位碳原子咪唑基，第66位酪氨酸的。a-β键脱氢反应之后，导致芳香团与咪唑基结合。这样GFP分子中形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色团，该过程可自动催化合成。GFP晶体结构(如图)显示，蛋白中央是一个圆柱形水桶样结构，长420nm,宽240nm，由11个围绕中心a螺旋的反平行β折叠组成，荧光基团的形成是从这个螺旋开始，桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖，底部由1个短的垂直片段覆盖，生色团位于大空腔内。 GFP的晶体结构 3.2 GFP在生命科学研究中的应用 GFP虽能自发荧光，但野生型GFP荧光较弱。为了改善GFP荧光特性，对GFP进行了突变和重组实验。某些突变使GFP明显地改变激发和释放波谱，或增加GFP的可溶性或表达量。Pang等获得的GFP突变型比野生型亮度增强20倍;Tian等发现野生型GFP是低水平表达，而改良后的GFP表达量增加100倍。Cormack等获得的三位点替代突变体的荧光强度比野生型高100倍，而且在自然光下就能观察到绿色荧光，使得gfp作为报告基因更为灵敏和迅速。Confocal能有效消除同一焦平面上非检测点的杂散荧光和非焦平面荧光的干扰，使分辨率提高，获得清晰图象，而且它具有逐层扫描功能，可对组织细胞进行无损伤的系列光学切片。Confocal的应用更有利于GFP在生物学研究中的应用。 应用DNA亚克隆技术，将目的基因与GFP基因构成融合基因，通过愈伤组织转化法、基因枪、显微注射、电激转化等方法转化合适的细胞，利用目的基因的基因表达调控机制，如启动子和信号序列来控制融合基因的表达，在荧光显微观察系统下监测融合蛋白在细胞内的存在状态（王关林等，1998）(Akane Kamigaki etal.，2003)。 用GFP还可以用于基因沉默、启动子活性、细胞信号转导和细胞局部区域的pH、内生菌和植物相互作用研究等。GFP在动物学研究方面的应用也非常广泛(比如用于研究肿瘤发生机制、转移机制、基因治疗等)。 gfp用作报告基因有众多优点：1灵敏度高，易检测并且是