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德国小蠊酸性磷酸酯酶测定条件方法探究摘要： ［目的］ 探索德国小蠊（Blattella germanica）酸性磷酸酯酶的最佳测定条件。［方法］ 采用二次回归通用旋转组合设计方法建立德国小蠊酸性磷酸酯酶测定中缓冲液pH值、反应温度、水浴时间、底物浓度等测定条件的数学模型，根据该模型寻求测定条件的最优组合。［结果］ 本次试验得到回归方程y#710; = 0.181 57 - 0.012 08x1 + 0.028 75x2 + 0.025 58x3 - 0.003 83x4 + 0.001x1 x2 - 0.006 13x1 x3 + 0.000 625x1 x4 + 0.010 63x2 x3 + 0.000 125x2 x4 + 0.000 25x3 x4 - 0.008 37x12 - 0.002 62x22 - 0.004 75x32 - 0.009 87x42（R2 = 0.915 6，Se = 0.000 612 57）。方程的失拟性检验F = 3.59 0.05）；回归方程的显著性检验F = 12.39 F0.01（14，16） = 3.45（P 0.05）and there was statistically significance（F = 12.39 F0.01（14，16） = 3.45，P 因此，n = mc + 2p + mo，且这n个点是分布在3个半径不相等的球面上，其中：mc个点分布在半径为ρc=的球面上；2p个点分布在半径为ργ=γ的球面上；mo个点分布在半径为ρo= 0的球面上 本次试验共研究了4个因子，根据二次回归通用旋转组合设计试验的参数设计，本次试验的参数如下：p = 4；mc = 16；γ = 2；mo = 7（由参数设计表查得）； n = 31 1.2.2 试验因素转换 参照二次回归通用旋转组合设计［7-12］，将本次试验因子转化为规范变量的因素水平，见表1 1.3 试验方法和安排 取室内饲养的德国小蠊雄虫若干只，取其中肠，加0.1 mmol/L冰冷醋酸缓冲液少许（pH值依表1而定）混合匀浆，于4 ℃、8 000 r/min，离心15 min，取上清液为酶源，待测 根据4因子5水平二次回归通用旋转组合设计结构矩阵［11，12］，对31个组合进行试验，共重复3次，每次重复中各组合测2个样品，每样品测3次吸光度值。具体试验安排见表2 2 结果 2.1 数学模型的建立 应用国际通用软件包SAS的REG过程拟合回归模型［9，11］，NLP过程求最优化配方［13］。方差分析表明，同一实验组合内其重复间和样本间差异均未达到显著水平。因此，本项目将每组合的样本平均值作为观测值建立数学模型 根据通用方程： 得到本次试验的回归方程： y#710; = 0.181 57 - 0.012 08 x1 + 0.028 75 x2 + 0.025 58 x3 - 0.003 83x4 + 0.001 x1 x2 - 0.006 13 x1 x3 + 0.000 625 x1 x4 + 0.010 63 x2 x3 + 0.000 125 x2 x4 + 0.000 25 x3 x4 - 0.008 37 x12 - 0.002 62 x22 - 0.004 75 x32 - 0.009 87 x42 （1） R2 = 0.915 6，Se = 0.000 612 57，回归方程的失拟性检验F = 3.59 0.05）；回归方程的显著性检验F = 12.39 F0.01（14，16） = 3.45（P 利用NLP过程求得本次试验设计水平内x1、x2、x3和x4的值分别为-0.79、2、2和0时，吸光度取最大值，即本次实验研究德国小蠊酸性磷酸酯酶测定的最佳条件为：在波长400 nm下，缓冲液pH 4.42，反应温度47℃，水浴时间50 min，底物浓度7.5×10-3 mol/L 3 讨论 二次回归通用旋转组合设计方法具有试验次数少、计算简便，可部分清除回归系数间的相关性等优点，并有助于克服回归正交设计中二次回归预测值的方差依赖于试验点在因子空间中位置的缺点［13］。本次实验研究表明，在德国小蠊酸性磷酸酯酶测定中，缓冲液的pH值、水浴时间、反应温度、底物浓度均对吸光度有明显影响。由模型分析得知，在所设计的水平内，醋酸缓冲液的pH值（x1）和底物浓度（x4）均与吸光度呈开口向下的抛物线关系，水浴时间（x2）、反应温度（x3）与吸光度呈明显正相关。水浴时间和反应温度是影响测定的关键因子，本次实验研究德国小蠊酸性磷酸酯酶测定的最佳条件为：在波长400 nm下，缓冲液pH 4