蛋白酶体β5亚单位过表达对氧化环境下人晶状体上皮细胞的影响论文.docVIP

　　蛋白酶体β5亚单位过表达对氧化环境下人晶状体上皮细胞的影响论文 张铁英， 柳夏林， 吴明星， 刘奕志 【摘要】 【目的】 探讨蛋白酶体β5亚单位(PSMB5)基因过表达对氧化条件下晶状体上皮细胞的影响。【方法】构建重组质粒pcDNA3.1－PSMB5并将其转染入人晶状体上皮细胞株SRA01/04中，形成稳定表达，同时设pcDNA3.1空载体为对照组。RT-PCR法及B5基因及蛋白的表达情况。H2O2分别作用PSMB5转染细胞及空载体转染细胞，MTT法检测细胞增殖能力的变化。【结果】 转染后用G418筛选3周后，获得PSMB5转染及空载体转染的G418抗性的细胞克隆。转染PSMB5基因的细胞PSMB5 mRNA表达强度明显增高.freele subunit β5 (PSMB5) gene overexpression in human lens epithelial cells under the oxidative condition. 【Methods】 The rebinant plasmid pcDNA3.1-PSMB5 an lens epithelial cell line SRA01/04 to form stable transfection, and empty pcDNA3.1 e time as control. RT-PCR and B5 gene and protein expression. Cell viability assay ed using 3-4,5dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide substrate (MTT) after the above cells pty vector RNA in the cells transfected pty vector or non-transfected cells; the expression of PSMB5 protein pty vector transfected cells. Cell viability of PSMB5 transfected cells pty-transfected cells under the loe β5 catalytic subunit can play protective role to human lens epithelial cells under the loent. Key e; PSMB5; lens; viability 白内障是全球最主要的致盲眼病，其发病机理仍不清楚。目前普遍认为氧化损伤是年龄相关性白内障形成中的重要因素，并且在体内、外实验中得到证实。氧自由基使晶状体内的蛋白质受到损伤，这些异常蛋白质蓄积会导致细胞的功能异常。蛋白酶体作为细胞内蛋白质降解的主要途径之一，能够有效地清除晶状体内异常的蛋白质，维持晶状体的透明性1。位于蛋白酶体核心部分20S的β5亚单位（beta 5 subunit of proteasome, PSMB5）具有糜蛋白酶样酶活性，是蛋白酶体所具有的三大主要的酶活性之一2。蛋白酶体系统是细胞内蛋白质降解的重要途径之一，而PSMB5在降解蛋白质过程中发挥重要的蛋白水解酶的作用。已有研究证实，在年龄相关性白内障等疾病中，蛋白酶体的蛋白水解酶功能均不同程度降低 3。氧自由基，特别是H2O2能明显抑制蛋白酶体的活性4，最近的研究表明氧化损伤对蛋白酶体亚单位的表达有抑制作用5 。我们用基因转染技术将含有PSMB5基因的真核表达载体转入人晶状体上皮细胞系SRA01/04内，建立稳定高表达PSMB5蛋白的晶状体上皮细胞，并用H2O2进行处理，分析PSMB5蛋白对晶状体上皮细胞的影响，为年龄相关性白内障的发病机制及防治方法提供依据。 1 材料与方法 1.1 材 料 人晶状体上皮细胞株SRA01/04、大肠杆菌菌株DH5α及真核表达载体pcDNA-3.1由本实验室保存；新生牛血清及DMEM培养基（Gibco公司）；引物合成（北京赛百盛公司）；Trizol试剂（美国Invitrogen公司），全自动测序由Invitrogen公司完成；限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ及T4连接酶（TaKaRa公司）；牛小肠碱性磷酸酶（BCIP，上海生工生物工程服务有限公司）；RT-PCR试剂（TOYOBO公司）；质粒提取试剂盒及脂质体SuperFect（QIAGEN）。 1.2 PSMB5真核表达载体的构建 根据GeneBank的PSMB5基因序列设计上下游引物，在其两端分别加入HindⅢ及EcoRⅠ的酶切位点序列。F：5′-GCGAAGCTTATGGCGCTT GCCAGCGTGT-3′，R：5′