生物分离工程-第八章 电泳及电色谱2009.ppt

第八章 电泳及电色谱 内容简介 基本理论 凝胶电泳 等电聚焦 二维电泳 逆向作用色谱电泳 毛细管电泳和色谱 连续电泳和电色谱 第一节 基本理论 真实电泳速度 在实际过程中，根据双电层理论，荷电溶质的表面附近存在距表面由高到低的反离子分布。当荷电溶质的表面电位（φ0）很小时，电位沿表面附近半径方向的变化可用如下的指数函数表示， 真实电泳速度 考虑到双电层中电位分布情况，带电粒子的迁移率变为 在一定pH条件下（用buffer），不同大小、形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率m表示），各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。 若颗粒本身向负极移动，则其表观泳动速度将比其本来的泳动速度快；若颗粒本身向正极移动，则其表观泳动速度慢于其本来的泳动速度。净电荷为零的颗粒，也会随水向负极移动。 第二节 凝胶电泳 2.1 电泳的分类 自由界面电泳：又称移动界面电泳（moving boundary electrophoresis, MBEP），指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。 区带电泳:（zone electrophoresis, ZEP）指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。 支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。 按支持介质种类的不同，区带电泳可分为： ①纸电泳：用滤纸作为支持介质，多用于核苷酸的定性定量分析。（薄层色谱适合观察实验现象，不适合大量制备样品） ②醋酸纤维素薄膜电泳：医学上，常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。 以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。 2.2 SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE）简称SDS－ PAGE。 是目前测定蛋白质亚基相对分子量（relative molecular mass, Mr）的一种最好的办法 。 2.3 不连续凝胶电泳 不连续电泳由两层胶组成，浓缩胶负责通过电泳把样品压缩成一个薄层，避免因出发点不同而造成的分离误差。（运动员起跑线要一致）这也是很多色谱加样过程中要求少加样，加样均匀的原因。 分离胶主要起蛋白分离作用。 不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳 系统的不连续性表现在以下几个方面： 1.凝胶由上、下两层凝胶组成，两层凝胶的孔径不同，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。 2.缓冲液离子组成及各层凝胶的pH不同。电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液，而分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 3. 在浓缩胶pH条件下，甘氨酸解离带电少（pI=6.0) ，其泳动率小于氯离子，大于蛋白。氯离子迁移率最快，由于快离子的迁移率最大，就会很快超过蛋白质，因此在快离子的后边形成一个离子浓度低的区域即低电导区（k值很低）。电导与电位梯度（E)是成反比的，而形成高电位梯度，使离子泳动速率增加。 v = m·E= m·J/K (k电导率，电流密度J ） 这种高电位梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。当快离子、慢离子和蛋白质迁移率和电位梯度的乘积彼此相等时，则三种离子移动速度相同。在快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立之后，则在快离子和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面。（两边同种电荷的排斥压缩） 第三节 等电聚焦 利用蛋白质具有不同等电点的特性，以聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有各种连续 pI 的小分子混合物）的电泳方法称聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF） 形成连续梯度的化合物 IEF的关键是调配稳定的连续pH值梯度，一般采用氨基酸混合物或氨基聚合羧酸，其带有许多正负电荷，这类物质具有与蛋白质相近似的等电点范围，缓冲能力强，pH值梯度稳定。其结构如下 用于等电聚焦的主要载体两性电解质 Ampholine(瑞典LKB公司) 由许多脂肪族的多氨基多羧基的异构体和同系物组成，它们具有连续改变的氨基与羧基比 Servalyte (德国Serva 公司) 产品Biolyte Pharmalyte (瑞典Pharmacia 公司) 产品分为九种pH范围 稳定pH梯度的形成 在电场作用下，组成溶液的无机盐电解质（如硫酸钠等）在阳极聚焦硫酸而在阴极聚焦氢氧化钠。如果此时有载体存在于溶液中，则它们在阳极的酸性介质中就会得