生物工程下游技术 第四章 沉淀法.ppt

第四章 沉淀法 ⑶许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。 ⑷生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断。 基本概念?? 通过加入某种试剂或改变溶液条件，使生化产物以固体形式（沉淀和晶体）从溶液中沉降析出的分离纯化技术称为固相析出技术。?? 结晶法：在固相析出过程中，析出物为晶体时称为结晶法。?? 沉淀法：在固相析出过程中，析出物为无定形固体时则称为沉淀法。常用的沉淀法主要有盐析法、有机溶剂沉淀法和等电点沉淀法等。? ◆沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。 ◆通过沉淀达到浓缩的目的，或者通过沉淀，固液分相后，除去留在液相或沉积在固体中的非必要成分； ◆沉淀可以将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。沉淀方法用于分离纯化是有选择性的，即有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分。 ◆沉淀分离在生物分离过程中应用相当广泛。一般情况下，沉淀分离方法在生物下游加工过程中通常作为初级分离技术加以使用，但在实际过程中也有仅通过沉淀分离得到目标产品的工业实例。 基本原理： 根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。 沉淀的分类 在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是： ⑴ 中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。⑵ 有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。 ⑶ 选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。 ⑷ 等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。⑸ 有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。 蛋白质组成 20种氨基酸构成的两性高分子电解质，包括疏水性氨基酸和亲水性氨基酸 蛋白质折叠趋势 疏水性氨基酸：向内部折叠的趋势 亲水性氨基酸：分布于蛋白质外表面的趋势 结果 在蛋白质三维结构中仍会有部分疏水性氨基酸残基暴露于表面，在蛋白质表面形成一定的疏水区 沉淀策略及方法 策略 破坏蛋白质周围的水化层 降低双电层厚度（ζ电位） 沉淀方法 改变溶液pH值 加入无机盐或改变无机盐种类 加入水溶性有机溶剂 添加脱水剂 第三节? 盐析法 定义： 蛋白质在高离子强度的溶液中溶解度降低、发生沉淀的现象称为“盐析”。 应用： 蛋白质和酶分离提纯 多肽、多糖和核酸也可以用盐析法进行沉淀分离 20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀 43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保留在上清。 一、盐析法的原理及特点 原理 形成离子对，部分中和了蛋白质的电性，排斥作用减弱而能相互靠拢，聚集起来。 中性盐的亲水性比蛋白质大，使蛋白质脱去了水化膜，使其沉淀。 二、影响盐析的因素 （一）离子强度和类型 一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。 盐析能力：半径小的高价离子在盐析时的作用较强，阴离子的盐析效果比阳离子好，尤其以高价阴离子更为明显。 PO4 3-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞I- NH4+＞K+＞Na+＞Li+ 盐析用盐要考虑几个因素：常用硫酸铵 (二）溶质（蛋白质等）种类的影响 （三）蛋白质浓度的影响??? 在相同的盐析条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，但蛋白质的浓度愈高，其它蛋白质的共沉作用也愈强，从而使分辨率降低， （四）温度的影响： 温度的变化会影响?值。在无盐或稀盐溶液中，大多数蛋白质溶解度是随温度升高而增大的，但在高盐溶液中常相反。 （五）PH的影响： 蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。 （NH4）2SO4 最常用： ① 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这