生物大分子的分离纯化及其应用20120508.ppt

生物大分子的分离纯化及其应用;Biomolecule;;;;;（1）分离纯化方法千差万别，没有一种标准方法可通用于各种生物大分子的分离制备； （2）制备几乎都是在溶液中进行的，难以准确估计和判断pH值、温度度等各种参数对溶液中各种组份的综合影响；;;; 蛋白质具有广泛的功能性质，每一种性质都会给食品及其加工过程带来特定的效果。具有生理活性的蛋白质类物质在维持现代人类健康方面已必不可少，在医疗和食品领域已逐渐得到应用。 如可将功能蛋白质如乳清蛋白、蛋清蛋白、大豆蛋白等添加到食品中制得各种功能性食品。 正是由于蛋白质与人类生活密切相关，所以对其质量和纯度要求也越来越高。; 蛋白质的分离纯化是研究蛋白质化学组成、结构及生物学功能、新蛋白质的发现和疾病分子诊断的基础； 分子克隆中，下游的处理和分析鉴定，基因工程产品的制备，也需要蛋白质的分离和纯化。 蛋白质分离纯化的总目标是增加制品的纯度，以增加单位蛋白质重量中靶蛋白的含量或生物学活性以达到目的，即从蛋白混合物中设法去除不要的杂蛋白和变性的靶蛋白，使靶蛋白的产量达到最高值。; 分离纯化的总体原则 一是保证靶蛋白结构的完整，防止降解和活性蛋白质的变性； 二是尽量满足研究与诊断对靶蛋白纯度的要求,纯化蛋白质总是希望纯度和产率均高。;蛋白质分离纯化的条件 ;缓冲液 盐、金属离子和螯合剂. 3. 还原剂 4. 去垢剂 5. 增溶剂 6. 蛋白酶抑制剂（pronase inhibitor） 7. 蛋白质的环境因素 ①表面效应的影响 ②温度的影响 ③储存; 蛋白质常存在于复杂的混合体系中，且稳定性较差，对温度、pH、机械剪切力等非常敏感、易于变性。 传统蛋白质的分离方法有吸附沉淀、溶媒、萃取、离子交换法等，这些工艺往往繁杂，提取时间长，消耗大量原料，能耗高。 随着生物技术的发展和对各种蛋白质结构和功能研究的深入，对蛋白质分离检测研究也有了迅速发展，出现了许多高效的分离纯化技术和手段，主要包括膜分离、高效液相色谱，毛细管电泳、分子印迹技术及联用技术。;生物样本;1. 离心技术简介 ;1.2 密度梯度离心;;2.膜分法 ; 膜分离技术在蛋白质的分离纯化方面具有非常广阔的应用前景，并向工业化发展。 e.g：学者用分离技术处理大豆乳清废水，以超滤膜截流分子，几乎可以回收所有多肽和蛋白质，再用纳滤膜进行浓缩，回收了蛋白质、低聚糖，又大大降低了废水排放量，取到了满意效果。; 它也存在一定的问题，如在操作中膜面会发生污染，使膜性能降低，故又必须采用与工艺相适应的膜面清洗方法；而且单采用膜分离技术效果有限，因此有时需将膜分离工艺与其他分离工艺组合起来应用。 但是可以预见，随着膜分离技术的进一步发展，其势必将取代那些耗能大、费用高、处理不彻底、周期长、易造成环境污染的传统单元操作，如沉淀、离心、过滤等，并使产品成本降低，质量提高。;;6.高效液相色谱法;6.1 反相高效液相色谱;图 1 人的胶原蛋白I型α1和α2键的色谱分离 ; 其分离蛋白质和酶等生物大分子具有速度快、分离性能好，重复性好，溶剂和流动相易除去等优点。 在所有的液相色谱法中反相色谱的分离性能最好。 但最大的缺点是很多蛋白质或酶在分离过程中失活，而且回收的样品中总含有有机溶剂。 ;6.2 离子交换色谱;;;6.3凝胶过滤层析 ;;7.电泳;7.1凝胶电泳;7.1.2丙烯酰胺凝胶电泳的优点 ;7.1.3凝胶电泳的应用 ;7.2毛细管电泳;七种分离模式： 毛细管区带电泳(CZE)、 胶束电场毛细管电泳(MECC)、 毛细管等速电泳(CITP)、 毛细管凝胶电泳(CGE)、 毛细管等点聚焦(CIEF)、 毛细管电色谱(CEC)、 亲和毛细管电泳(A毛细管电泳)。; 毛细管电泳在蛋白质分离分析中的应用主要包括： 肽和蛋白的鉴别分析、结构分析、微量制备，以及蛋白的定量测定、纯度检测、非均一性检测、稳定性和动力学研究。 有学者对240例异常蛋白质血症患者标本使用多通道毛细管电泳与琼脂凝胶电泳对照， 结果显示毛细管电泳检出异常蛋白质敏感性高，且诊断结果一致。;7.3等电聚焦电泳;;8.联用技术;参考文献;Thanks for your attention!!