第五章 蛋白质理化性质的分析.pptVIP

第一章绪论 第二章蛋白质结构基础 第三章蛋白质分子设计 第四章蛋白质的修饰和表达 第五章蛋白质理化性质的分析和鉴定 第六章蛋白质工程的实际应用 氨基酸的化学性质（一） 氨基酸的化学性质（三） 3 黄色反应 含有苯环结构的氨基酸，遇硝酸后被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成深橙色的硝醌酸钠。 4 考马斯亮蓝反应 考马斯亮蓝G250具有红色和蓝色两种色调。 在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色。 与蛋白质疏水结合后变成蓝色。 与X射线及晶体衍射有关的部分诺贝尔奖获得者名单 The 14 possible BRAVAIS LATTICES {note that spheres in this picture represent lattice points, not atoms!} 核磁共振的发展 1971年比利时的J.Jeener首次提出二维核磁共振的概念。 20世纪80年代末期遗传工程技术迅速发展，已成功制备了许多15N和13C等稳定同位素标记的蛋白质样品，使二维异核核磁共振方法得以实施 20世纪90年代初期A.Bax等人提出了异核三维和四维核磁共振方法。已可用于确定分子量为15-25kDa蛋白质分子的溶液三维空间结构。NMR技术最大的优点在于它能对在溶液中和非晶态的蛋白质进行测量 多维核磁共振波谱技术成为确定蛋白质和核酸等生物分子溶液三维空间结构的唯一有效手段。近几年来异核核磁共振方法迅速发展，已可用于确定分子量为15～25KDa蛋白质分子溶液的三维空间结构 蛋白质纯度和分子量测定 一、蛋白质分子量的测定 蛋白质最小分子量的测定 最小分子量=原子量/组成百分数×100 超速离心法：分子大小和形状相同的蛋白质以相同的速度沉淀 SDS电泳法：蛋白质所带电荷和分子大小不同，在电场中的电泳速度各异 分子筛层析法：球形蛋白质 二、蛋白质纯度的测定 层析法： 电泳法：PAGE 免疫化学方法：更具抗原与抗体反应的特异性 蛋白质末端分析 蛋白质二硫键分析 二硫硝基苯甲酸 (DTNB) Ellman反应 在pH8.0时，412nm波长有强烈吸收 硫硝基苯甲酸 可用于比色法定量测定半胱氨酸的含量 λ/nm λ/cm-1 能量升高 电磁波谱与有机光谱的对应关系 X射线晶体结构分析 1) X射线 （X-ray） 1895年伦琴发现用高速电子冲击固体时，有一种新射线从固体上发出来 阴极 阳极 + - 　　1912年劳埃等人实验证实了X射线与晶体 相遇时能发生衍射现象，证明了X射线具有 电磁波的性质，成为X射线衍射学的第一个 里程碑。当一束单色X射线入射到晶体时， 由于晶体是由原子规则排列成的晶胞组成， 这些规则排列的原子间距离与入射X射线波长有相同数量级，故由不同原子散射的X射线相互干涉，在某些特殊方向上产生强X射线衍射，衍射线在空间分布的方位和强度，与晶体结构密切相关????  X射线衍射原理 晶体结构与空间格子-C 衍射线空间方位与晶体结构的关系可用布拉格方程表示： 晶体生长的理化条件P135 蛋白质晶体生长的生化条件： pH值、离子强度、沉淀剂和添加剂 在摸索晶体生长的过程中，首先是缓冲液的选取，其次是沉淀剂，最后是蛋白质的浓度 蛋白质晶体生长的物理条件： 温度、震动、溶剂的清洁度、试剂的纯度、重力等因素 物理条件控制了晶核形成的速度和晶体生长的速度 单晶衍射分析应用 能提供晶体内部三维空间的电子云密度分布，晶体中分子的立体构型、构像、化学键类型，键长、键角、分子间距离，配合物配位等 常见有机波谱 核磁共振 核磁共振是1946年由美国哈佛大学普舍尔(E.M.Purcell)小组和斯坦大学的布洛赫（F.Bloch）小组同时独立发现的，它的研究对象是原子核的磁矩在磁场中对电磁波的吸收和发射．根据核磁共振峰的化学位移和自旋-自旋分裂可以测定分子的静态结构、 研究化学交换等 　 原子核由质子和中子组成．质子、中子与电子一样具有自旋运动，因而核也产生磁矩 　 并非所有原子核自旋都具有磁矩，实验证明只有那些原子序数或质量数为奇数的原子自旋才具有磁矩．例如：１H，１３C，１５N，１７O等　 让处于外磁场的自旋核接受一定频率的电磁波辐射，而辐射的能量又恰好等于高低两种不同取向的能量差时，质子就吸收电磁辐射，从低能态跃迁到高能态而产生共振现象，称为核磁共振（NMR） 以吸收的能量的强度为纵坐标，以吸收的频率为横坐标，用记录仪描绘下来，分子中各个核在核磁共振谱上即出现吸收峰，成为核磁共振谱图 质谱 质谱方法(Mass Spectroscope,MS):可以正确测定蛋白质分子的质量而进行蛋白质分子鉴定、蛋