提高质谱分析质量的一种可逆式结合的蛋白或多肽的纯化和浓.PDFVIP

创 新 No. 3 Eppendorf PerfectPure C-18 Tip 蛋白质纯化吸头： 提高质谱分析质量的一种可逆式结合的蛋白或 多肽的纯化和浓缩的高重复性方法 摘要 Eppendorf PerfectPure C-18 Tip 是蛋白质质谱分析的理想工具，它可用于质谱上样前小量蛋白质或多肽的纯化和浓缩， 能有效的提高质谱分析的质量。 PerfectPure C-18 Tip 为分子量在 15,000 道尔顿以下的蛋白质或多肽进行了特殊的优化处理， 纯化蛋白的结合基质固定于吸头出口端，不同批次间的吸头都具有均一的反压特性，这对样品操作的重复性提供了有力的保 证，而且对于高通量的纯化操作，如使用 8 道移液器或全自动移液操作工作站有着十分重要的意义。 PerfectPure C-18 Tip 的纯化操作可采用三种洗脱方案，标准方法中使用已腈为洗脱剂，另外两种方案中需要额外使用正丙醇，它是一种疏水性更 强的溶剂，可以进一步提高蛋白的回收率。 本文中的一系列实验方法均为用于 Eppendorf PerfectPure C-18 Tip 批间质检的方法。这些实验结果一方面能确保用户 使用的是高质量的产品，同时这些实验结果也表明了 Eppendorf PerfectPure C-18 Tip 在重复性、灵敏性和回收率方面的 明显优势。为了验证吸头使用的重复性效果，我们测定了一定量气流通过吸头的反压大小。通过处理毫微微摩尔（femtomole） 数量级的蛋白量，来检验吸头的灵敏性，测定最小的蛋白纯化量。最后通过回收 α-酪蛋白（α- casein ），牛血清白蛋白 （bovine serum albumin）和胎球蛋白（fetuin）消化后的主要多肽成分，来检测回收效率。 引言 未经纯化的多肽质谱分析 蛋白质组学是指对蛋白质组的分析、蛋白的表达，是对 基因组学的功能性注释。二维电泳是主要分析平台之一（一 维：电荷 /PI；二维：分子量）（Bernard 等，未发表），可用 于分析如疾病、刺激或分化引起的蛋白表达异常。这些异常 表达的蛋白可以从电泳后的蛋白凝胶中分离、消化和抽提出 来，然后进行质谱分析（MS ），并结合生物信息数据库检索 Eppendorf PerfectPure C-18 纯化的多肽质谱分析 和分析。在做 MALDI 质谱分析前，残留在二维电泳消化产 物中的盐和杂质必须去除，纯化后的蛋白产物才可以在矩阵 中形成共结晶，避免产生离子抑制峰和去污剂的干扰峰。为 了证实纯化步骤的重要性，图 1 比较了未经纯化和使用 PerfectPure C-18 Tip 纯化后的光谱分析结果。 图 1 ： 7 种多肽片段分别以 1pmol 的量混合成多肽混合物标准样品 含 （Bruker Daltonics Part # 20 61 95），总量为 10ng，溶解在 20 μl 500 mM 尿素和 25 mM 碳酸氢铵的缓冲液中。样品采用 Eppendorf PerfectPure C-18 Tip 是一种方便、快捷的纯化工具 ， PerfectPure C-18 蛋白纯化吸头进行脱盐、浓缩后，取三分之一样 它不仅可以用于去除盐和杂质，同时还能浓缩微量多肽用以 品上样于 MALDI 靶板上，同时与未经纯化的多肽溶液 的 MA LDI-