植物组织培养技术（高教版）电子教案：植物组织培养操作技术01.docVIP

第2章 植物组织培养技术 第三节 植物组织培养操作技术（1） 一、授课章节 二、学时安排 2学时 三、教学目标 1．掌握组培的一般工作程序。 2．掌握不同类型培养器皿和用具的洗涤技术。 3．了解常用消毒灭菌方法的原理，掌握其操作技术，能根据物品种类正确选用消毒灭菌方法。 四、教学重点、难点分析 重点： 常用的消毒灭菌技术。 难点： 灭菌和消毒的区别及无菌意识的树立。 五、教具 电化教学设备、教学方法 讲授法，、教学过程 Ⅰ.导入 本次课要介绍的是II.新课 【注意事项】（1）配制时重铬酸钾溶液一定要冷却后才能加浓硫酸，且只能把浓硫酸缓慢加入重铬酸钾溶液中，决不能将重铬酸钾溶液或蒸馏水倒入浓硫酸中。（2）由于铬酸洗涤液具有极强的氧化能力和腐蚀作用，故不要用手直接接触洗涤液。 （二）各类器皿和用具的洗涤方法 1.新的玻璃器皿：使用前先用1%稀盐酸浸泡12～24h→用毛刷蘸洗衣粉水刷洗干净→流水冲洗3～4次→最后用蒸馏水冲淋1遍→晾干（或烘干）后备用。 2.已用过的培养器皿：除去容器内的残渣→自来水冲洗→浸泡在洗衣粉水中15～30min→用毛刷刷洗干净→流水冲洗3～4次→最后用蒸馏水冲淋1遍→晾干（或烘干）后备用。 3.已被霉菌等杂菌污染的器皿：121℃高温高压蒸汽灭菌30min→趁热倒去残渣→自来水冲洗→浸泡在洗衣粉水中15～30min→用毛刷刷洗干净→流水冲洗3～4次→最后用蒸馏水冲淋1遍→晾干（或烘干）后备用。 4.移液管、量筒等量器：铬酸洗涤液中浸泡2h以上→取出后在流水中冲洗30min→蒸馏水冲淋1次→晾干（或烘干）后备用。 5.载玻片和盖玻片：洗涤液中浸泡数小时→水洗→绸布擦干→放在95%的洒精中备用。 6.解剖刀、镊子、剪刀等：新购置金属器皿因其上有润滑油或防锈油，用蘸有四氯化碳的棉布擦去油脂，再用湿布擦净，干燥备用。每次使用后先用洗衣粉水刷洗，再用酒精擦拭。 二、灭菌与消毒技术 （一）灭菌与消毒的区别 1．有菌和无菌的范畴 有菌的范畴是：凡是暴露在空气中的物体，接触自然水源的物体，至少它的表面都是有菌的。 无菌的范畴是：经高温灼烧或一定时间蒸煮过后的物体，经其他理化灭菌方法处理后的物体一般可认为是无菌的。 2.灭菌与消毒的区别 灭菌是指用物理或化学方法杀死物体表面和孔隙内一切微生物或生物体。 消毒是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。 由灭菌和消毒的含义可以看出，二者的主要区别是：灭菌是把所有有生命的物质全部杀死；而消毒主要杀死或抑制物体表面的微生物，但芽孢、厚垣孢子一般不会死亡。 （二）常用的消毒灭菌方法 （三）消毒灭菌技术 1.环境消毒：方法主要有空气过滤灭菌、紫外线照射消毒、喷雾消毒和熏蒸消毒等。 ●空气过滤灭菌：成规模的植物组织培养车间可采用空气过滤系统对整个环境进行空气过滤灭菌，这种方法投入较高，操作要求比较严格，一般较少采用。组织培养中普遍采用的是对无菌操作的微环境进行空气过滤灭菌，如超净工作台的局部无菌环境。 ●紫外线照射消毒：利用紫外光波照射灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。缓冲间、接种间、培养间等均可采用紫外线照射消毒，一般照射20~30min。 ●喷雾消毒：利用70%～75%的酒精或0.2%的新洁尔灭对环境进行喷雾，既可以起到直接杀死环境中微生物的作用，又可以使飘浮的尘埃降落，防止尘埃上附着的杂菌污染培养基和培养材料。 ●熏蒸消毒：利用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，按2mL／m3用量，将甲醛置于广口容器中，加0.2g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿，关闭紧密，24h后打开门窗通风。 2.用具的消毒灭菌：根据用具种类不同分别采用干热灭菌、湿热灭菌、浸泡消毒、擦拭消毒等方法。 ●干热灭菌：利用烘箱进行烘烤灭菌的方法，适用于各种玻璃器皿和器械的灭菌消毒。方法是将清洗后的玻璃器皿和器械妥为包扎，放入箱内，将箱温控制在150～170℃，烘烤120min，即可达到灭菌效果。在干热条件下，细菌的营养细胞抗热性大为提高，故能源消耗大，又浪费时间，所以目前多采用湿热灭菌代替，接种工具也可采用消毒器烘烤和酒精灯外焰灼烧的方法消毒。 ●湿热灭菌：适用于培养基、玻璃器皿、棉塞、布制品及金属用具等的灭菌，一般灭菌掌握在0.1～0.15MPa压力下20～30min。 ●浸泡消毒：在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入70%～75%的酒精中浸泡，使用之前取出在酒精灯外焰上灼烧，待冷却后使用。 ●擦拭消毒：接种用具及超净工作台表面等使用前可用70%酒精或0.1~0.2%新洁尔灭溶液进行擦拭消毒。 3.培养基灭菌：培养基灭菌一般采用湿热灭菌，特殊情况下采用